基于網絡藥理學和分子對接技術探討復元活血通脈湯防治冠心病的作用機制

張海濤 喬盼 于智莘 王冰梅

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

冠心病(CHD)是由于冠狀動脈粥樣硬化或功能性改變導致心肌缺血缺氧而引起的心臟病，又稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病或缺血性心臟病，典型癥狀包括胸悶、胸痛及呼吸短促，易引發心肌缺血、缺氧、壞死、心力衰竭、心律失常等，如不及時搶救，病死率極高，嚴重威脅人類的身體健康。目前我國冠心病患者1 100萬例，防控形勢嚴峻〔1〕。西藥治療主要使用抗血小板聚集藥物和抗心肌缺血藥物，但長期使用副作用大，成本高，臨床應用受到限制。中藥治療CHD，效果明顯，價格適中，患者易接受。

復元活血通脈湯是由補陽還五湯與丹參飲加減化裁而成，由黃芪、黨參、桃仁、紅花、丹參、水蛭、川芎、枳殼、降香、柴胡、砂仁、山茱萸、桂枝、瓜蔞、甘草組成，有溫陽化氣、溫經通脈、活血化瘀之效。方中以黃芪、黨參為君藥大補宗氣，增強“陽化氣”的功能，使氣旺以促血行，瘀祛而不傷正。桃仁、紅花、丹參、水蛭、川芎為臣藥，化瘀通脈，使由于“陰成形”功能失常而導致的瘀血得以消散。枳殼、降香、柴胡、砂仁為佐藥，調和中焦脾胃氣機，使后天“陽化氣、陰成形”的功能正常。山茱萸“斂正氣而不斂邪氣”，防治活血化瘀藥效過猛而導致出血，達到祛瘀而不傷正的目的。桂枝溫通經脈，提高黃芪、黨參的“陽化氣”功能。瓜蔞、甘草為使藥，瓜蔞又為引經藥，引諸藥直達胸部，甘草調和諸藥。

該方應用普遍，效果明顯，但其具體作用機制尚不清楚。網絡藥理學基于系統生物學理論，運用數據挖掘技術綜合分析中藥復方防治疾病的交集靶點，并對交集靶點進行功能富集分析等，嘗試闡明中藥復方可能的作用機制，為中藥復方作用的分子機制提供研究基礎〔2〕。本研究基于網絡藥理學技術，探究復元活血通脈湯防治CHD的作用機制。

1 材料與方法

1.1復元活血通脈湯有效成分的篩選及靶點預測 首先分別檢索中醫藥整合藥理學研究平臺V2.0(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php，TCMIP)、中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP,http：//tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM數據庫(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，并結合已發表的中藥成分相關文獻〔3，4〕，得到復元活血通脈湯中15味中藥的有效成分及相關靶點，其中篩選條件〔5〕為口服生物利用度(OB)≥30%，藥物類藥性(DL)≥0.18。然后采用Perl軟件(V5.30.0)將中藥活性成分與相應靶點進行一一映射，并為篩選出的靶點添加基因名。

1.2CHD的靶點篩選 以“coronary heart disease”和“coronary disease”為關鍵詞，檢索Gene Cards數據庫(https：//genealacart.genecards.org/)、OMIM數據庫(https：//www.omim.org/)、Pharm Gkb數據庫(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD數據庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)和Drug Bank數據庫(https：//www.drugbank.ca/)疾病相關靶點，得到疾病相關靶點。

1.3復元活血通脈湯防治CHD的調控網絡構建 利用Perl軟件將復元活血通脈湯活性成分靶點和CHD疾病靶點進行一一映射，得到中藥復方活性成分與疾病的交集靶點，然后利用Cytoscape軟件(V3.7.1)進行網絡可視化，得到活性成分-交集靶點調控網絡。其中節點的類型有活性成分、靶點。

1.4靶點蛋白互作網絡(PPI)構建及核心靶點篩選 利用STRING在線軟件(https：//string-db.org/)將1.3得到的活性成分與疾病的交集靶點輸入軟件，篩選條件為種屬選擇人，最小互作分數值為0.9，保存相應結果文件。將所得文件輸入R語言計算，得到蛋白互作網絡靶點的條圖。見圖1。

圖1 中藥-疾病關鍵靶點的條圖

利用Cytoscape軟件(V3.7.1)的插件CytoNCA對PPI網絡進行拓撲分析，選取介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、度自由性(DC)、特征向量中心性(EC)、局部邊連通性(LAC)、網絡中心性(NC)等5個指標，其中，同時滿足大于5個指標中位數2倍的節點作為關鍵靶點，以盡可能篩選出關鍵靶點。

1.5分子對接分析 對復元活血通脈湯自由度排名靠前的有效成分和關鍵靶點進行分子對接，首先從Pub Chem網站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載藥物有效成分的2D結構，并利用ChemOffice軟件將2D結構轉換成3D結構，其次從PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/)獲取關鍵靶點的3D結構，并利用PyMOL軟件對關鍵靶點的3D結構刪除水分子及小分子配體，最后利用autodock vina1.1.2軟件完成分子對接分析。

1.6GO功能富集分析 見圖2，圖3，圖4。

圖2 生物過程

圖3 細胞組分

圖4 分子功能

將1.3得到的活性成分與疾病的交集靶點利用R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行處理，得到GO功能富集分析。

1.7KEGG通路富集分析 將1.3得到的活性成分與疾病的交集靶點利用R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行處理，得到KEGG通路富集分析見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析柱

1.8KEGG關系網絡構建 將1.3得到的活性成分與疾病的交集靶點和1.6得到的KEGG通路富集分析結果利用Perl 軟件進行一一映射，并利用Cytoscape軟件進行網絡可視化。其中節點的類型有KEGG通路和交集靶點。

2 結 果

2.1復元活血通脈湯活性成分及靶點篩選的結果 分別檢索TCMIP數據庫、TCMSP數據庫和BATMAN-TCM數據庫中復元活血通脈湯所有活性成分及相關靶點，并結合已發表的相關文獻，對篩選出的靶點添加基因名。根據OB和DL參數對復元活血通脈湯的活性成分進行篩選，分別得到甘草活性成分92個、丹參活性成分65個、降香活性成分37個、桃仁活性成分23個、紅花活性成分22個、黨參活性成分21個、山茱萸活性成分20個、黃芪活性成分20個、柴胡活性成分17個、瓜蔞活性成分11個、砂仁活性成分10個、川芎活性成分7個、桂枝活性成分7個、枳殼活性成分5個、水蛭活性成分1個。對所有活性成分相應的靶點添加基因名后，共得到活性成分的靶點基因3 927個，其中甘草靶點基因1 531個、丹參靶點基因825個、降香靶點基因521個、黃芪靶點基因405個、黨參靶點基因193個、山茱萸靶點基因108個、枳殼靶點基因103個、桃仁靶點基因102個、砂仁靶點基因63個、川芎靶點基因39個、瓜蔞靶點基因31個、水蛭靶點基因3個、紅花靶點基因2個、柴胡靶點基因1個。

2.2CHD的靶點篩選結果 以“coronary heart disease”和“coronary disease”為關鍵詞，分別檢索Gene Cards數據庫、 OMIM數據庫、Pharm Gkb數據庫、TTD數據庫和Drug Bank數據庫，取并集后得到疾病相關靶點2 180個。

2.3復元活血通脈湯防治CHD的的調控網絡構建 利用Perl軟件將復元活血通脈湯活性成分靶點3 927個和CHD疾病靶點2 180個取交集后得到211個交集靶點，這211個交集靶點對應復元活血通脈湯中236個活性成分。甘草活性成分76個、丹參活性成分55個、降香活性成分25個、桃仁活性成分16個、砂仁活性成分4個、柴胡活性成分1個、川芎活性成分2個、黨參活性成分9個、瓜蔞活性成分6個、黃芪活性成分6個、山茱萸活性成分6個、水蛭活性成分1個、枳殼活性成分3個、多味藥共有活性成分26個。

2.4PPI的構建及核心靶點篩選 PPI網絡使基因、蛋白之間相互作用關系可視化，為篩選中藥復方調控疾病發生的關鍵靶點提供了可能。據圖1可知，中藥-疾病核心基因按鄰接節點數目由多到少依次為：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1，又稱蛋白激酶B(AKT1或PKB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、MAPK3、信號傳導及轉錄激活因子(STAT)3、JUN、熱休克蛋白(HSP)90AA1、APP、MAPK14、MAPK8、RELA、表皮生長因子受體(EGFR)、雌激素受體α(ESR1)、FOS、白細胞介素(IL)6、蛋白激酶Cα(PRKCA)、視網膜母細胞瘤基因(RB)1、血管內皮生長因子 (VEGF)A、表皮細胞生長因子(EGF)、糖皮質激素受體基因(NR3C1)、類視黃醇X受體α(RXRA)、CCND1、CDKN1A、蛋白激酶Cβ(PRKCB)、MYC、核受體輔激活蛋白(NCOA)1、胱天蛋白酶(CASP)8、胱天蛋白酶(CASP)3、STAT1、BCL2、CREB1。鄰接節點數目越多，成為核心基因的概率越大。BC、CC、DC、EC、LAC、NC等大于2倍中位數的關鍵靶點有CCND1、MAPK8、JUN、MAPK14、AKT1、MAPK3、MYC、MAPK1、TP53、RELA、STAT3。這11個關鍵靶點是復元活血通脈湯防治CHD的核心作用靶點，有重要研究價值。見圖6。

圖6 中藥-疾病關鍵靶點篩選策略

2.5分子對接結果 為了進一步驗證網絡預測能力，本研究應用分子對接技術探討復元活血通脈湯防治CHD的作用機制。在復元活血通脈湯-CHD-靶點調控網絡中選取自由度較高的槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA作為候選對接藥效成分；選取關鍵靶點中的AKT1、JUN、STAT3作為候選對接靶點，進行分子對接。成分與靶點的結合能及形成氫鍵數量是評價分子對接結果的重要依據。結合能越低，氫鍵數量越多，結合就越穩定，靶點與分子作用的可能性就越大。從分子對接結果可知，槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA與3個靶點的結合能均較低，且能形成氫鍵，表明復元活血通脈湯可有效防治CHD。見圖7，表1。

圖7 核心成分與靶點對接示意圖

表1 復元活血通脈湯核心成分與靶點的結合情況

2.6GO功能富集分析 GO功能富集分析主要包括生物過程(BP，圖2)、細胞組分(CC，圖3)、分子功能(MF，圖4)三部分。通過R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行GO功能富集分析后，富集比較明顯的前10個生物過程包括：對金屬離子的反應、對營養水平的反應、對抗生素的反應、對類固醇激素的反應、對活性氧的反應、氧化應激反應、對脂多糖的反應、對氧含量的反應、對細菌來源分子的反應、對外源刺激的反應。富集比較明顯的前10個細胞組分包括：膜筏、膜微區、膜區、受體復合體、突觸后膜的組成成分、突觸后膜的內在成分、突觸膜的固有成分、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、突觸膜的內在成分、突觸前膜的固有成分。富集比較明顯的前10個分子功能包括：核受體活性、轉錄因子活性(直接配體調節的序列特異性DNA結合)、類固醇激素受體、腎上腺素能受體活性、G-蛋白耦聯胺受體活性、兒茶酚胺結合、輔因子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、磷酸酶結合、轉錄因子活性(RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合)。

2.7KEGG通路富集分析 通過R語言軟件的Bioconductor生物信息軟件包進行KEGG通路富集分析后，富集比較明顯的前20個通路包括：糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、胰腺癌、TNF信號通路、IL-17信號通路、丙型肝炎、人巨細胞病毒感染、內分泌抵抗、膀胱癌、非小細胞肺癌、Th17細胞分化、細胞凋亡、弓形蟲病、小細胞肺癌、PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、麻疹。見圖5。

2.8KEGG關系網絡構建 106個交集基因可通過調節20個通路來影響CHD的發生。其中與信號通路相關的有糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、Th17細胞分化和PI3K-Akt信號通路；與癌癥相關的有前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌和小細胞肺癌；與病毒相關的有卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染和麻疹；與肝炎相關的有乙型肝炎、丙型肝炎。

3 討 論

CHD由于年老體衰、正氣虧虛、臟腑功能損傷、陰陽氣血失調、導致氣滯血瘀、胸陽不振、痰濁內生、心脈痹阻而發病。其中心、肝、脾、肺、腎五臟虛損是病之本，氣滯、血瘀、痰濁、寒凝是病之標，本虛標實是CHD病機特點。本方溫陽化氣、溫經通脈、活血化瘀。中藥復方所含成分復雜，藥理作用廣泛，本研究基于網絡藥理學技術研究復元活血通脈湯防治CHD的作用機制，篩選中藥復方主要活性成分及交集基因，并對交集基因進行功能富集分析，表明中藥復方可通過多成分、多靶點、多通路影響CHD發生。

本研究通過構建中藥復方-疾病-靶點調控網絡，發現復元活血通脈湯中236個活性成分通過調控211個交集靶點影響CHD的發生。這236個活性成分按 “度自由性”值排列前十的分別是：槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA、7-O-甲基異戊烯醇、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、柚皮素、(-)-前庭醇、隱丹參酮、新龍果堿。槲皮素對CHD有擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量和降血脂等作用，已被制成多種成藥廣泛使用〔6〕。槲皮素可通過提高膽固醇逆轉運途中相關轉運蛋白ABCA1和ABCG1的表達，下降血清IL-6、TNF-α水平，從而改善膽固醇的逆轉運功能和巨噬細胞內的炎癥反應，防治CHD〔7〕。山奈酚可通過抑制氧化應激和炎癥反應，防治動脈粥樣硬化，還可通過沉默調節因子(SIRT)1 介導的線粒體途徑，顯著增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制心肌細胞的凋亡〔8〕。木犀草素、山奈酚可通過抗脂代謝紊亂和抗細胞凋亡，保護大鼠離體心肌缺血/再灌注損傷〔9〕，其作用機制可能與提高心肌細胞中線粒體延長因子(MIEF)1表達有關〔10〕。丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過保護心肌缺血再灌注損傷，降低心肌梗死面積，改善冠狀動脈循壞，明顯提高CHD患者的左室舒張末徑(LVEDD)、心輸出量(CO)和左室射血分數(LVEF)等心功能指標〔11〕。柚皮素可通過抑制PI3K信號通路和升高血小板內cGMP水平等，抗血小板聚集和動脈血栓形成，防治CHD〔12〕。以上研究表明，槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA、柚皮素，能夠通過多通路防治CHD的發生，而復元活血通脈湯中這5種成分含量多，靶點多，是防治CHD的重要候選化合物。

本研究通過構建PPI網絡并進行核心靶點篩選，共篩選出30個核心靶點，前15個靶點(鄰接節點數大于20)分別是AKT1、MAPK1、MAPK3、STAT3、JUN、HSP90AA1、APP、MAPK14、MAPK8、RELA、EGFR、ESR1、FOS、IL-6、PRKCA。其中，AKT1〔13〕、MAPK1〔14〕、STAT3〔15〕、JUN〔16，17〕、ESR1〔18〕、FOS〔19〕、IL-6〔20〕、PRKCA〔14〕等已被實驗證實參與了CHD的病理過程，這些靶點可能也是復元活血通脈湯防治CHD的關鍵靶點。

GO功能富集分析表明復元活血通脈湯可能通過核受體活性、轉錄因子活性、腎上腺素能受體活性、G-蛋白耦聯胺受體活性、兒茶酚胺結合、輔因子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、磷酸酶結合等防治CHD。KEGG通路富集分析表明復元活血通脈湯可能通過糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、胰腺癌、TNF信號通路、IL-17信號通路、丙型肝炎、人巨細胞病毒感染、內分泌抵抗、膀胱癌、非小細胞肺癌、Th17細胞分化、細胞凋亡、弓形蟲病、小細胞肺癌、PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、麻疹等通路防治CHD。其中，實驗研究表明AGE-RAGE信號通路〔21〕、前列腺癌〔22〕、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎〔23〕、TNF信號通路〔24〕、IL-17信號通路〔25〕、丙型肝炎〔26〕、人巨細胞病毒感染〔27〕、內分泌抵抗〔28〕、Th17細胞分化〔29〕、細胞凋亡〔30，31〕、PI3K-Akt信號通路〔30，31〕等參與CHD的發病。

綜上，復元活血通脈湯中的主要活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹參酮ⅡA、柚皮素通過影響AKT1、MAPK1、STAT3、JUN、ESR1、FOS、IL-6、PRKCA等靶點，進一步調控AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等，防治CHD的發病。