異檸檬酸脫氫酶1基因突變對替莫唑胺干預下腦膠質瘤U87細胞凋亡的影響

羅剛，喻堅柏，陳濤，唐寧，李春輝

膠質瘤年發病率約為0.06%，目前用于神經膠質瘤的常規療法包括手術，放射和化學療法。膠質母細胞瘤病人的總生存期僅為12～15個月，與腫瘤復發和整體預后不良有關，老年病人的預后更差。替莫唑胺是一種烷化劑，可在多個位置引起DNA 堿基甲基化，導致DNA 損傷和細胞凋亡。由于其在血腦屏障通透性方面的表現及其治療效果，替莫唑胺已成為膠質瘤治療的首選化療藥物。然而，抗輻射和替莫唑胺化療是治療惡性神經膠質瘤的一個日益嚴重的問題，極大地影響了這些病人的預后。2008年，超過70%的原發性膠質瘤和繼發性膠質母細胞瘤中發現了異檸檬酸脫氫酶1/2（IDH1/2）的突變。IDH 突變的病人被認為比IDH 野生型（IDH1-WT）腫瘤的病人預后更好。特別是，IDH1 占 IDH 突變病例的最大比例，IDH1 中超過90%的突變被歸類為R132H突變。Arg132的其他IDH1突變發生在較低頻率，包括R132S和R132L。功能上，IDH1催化異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸（α-KG），并在細胞質和過氧化物酶體中產生尼古丁腺嘌呤二磷酸核苷酸（NADPH）。IDH1參與了許多細胞功能，包括葡萄糖感應，脂肪生成和細胞氧化還原狀態的調節。本研究自2019年1—5月探究IDH1基因突變對替莫唑胺干預下腦膠質瘤U87 細胞凋亡的影響，以期深入了解其生物學特性及其化療敏感性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只成年雄性健康SD 小鼠，體質量范圍為150～200 g，購自湖南中醫藥大學實驗動物中心。飼養室溫度（22±2）°C，相對濕度（50±10）%，自由進食和飲水，所有實驗動物均在相同條件下飼養，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 裸鼠模型及實驗分組

將60 只小鼠采用隨機數字表法分成3 組：野生 IDH1 基因（wIDH1）組 20只，在裸鼠背部皮下注射wIDH1 膠質瘤細胞（5×10個細胞）；突變IDH1 基因（mIDH1）組20 只，在裸鼠背部皮下注射mIDH1 膠質瘤細胞（5×10個細胞）；對照組20只，在裸鼠背部皮下注射對照膠質瘤細胞（5×10個細胞）。

通過細胞注射處理雄性裸鼠并喂食14 d，根據小鼠的表面區域通過胃管飼法用替莫唑胺（75 mg/d）處理5 d。隨后的觀察期持續21 d。根據函數V（mm）=π（ab）/6 計算腫瘤大?。╝ 為寬，b 為長度）。根據函數S（m）=0.06×m（kg）2/3計算表面積。計算腫瘤形成率和總化療效率。皮下荷瘤小鼠見圖1。

圖1 皮下荷瘤小鼠

1.3 細胞系和細胞培養

人惡性膠質母細胞瘤細胞系，U87 細胞和U251 細胞購自上海生物化學與細胞生物學研究所。將所有這些細胞系維持在高葡萄糖（Gibco，USA）的DMEM 培養基中，補充有10%胎牛血清（Gibco，USA），2 mmol/L 谷氨酰胺（Sigma，USA），抗生素（青霉素）100 U/mL 和鏈霉素100 μg/mL，在37°C的5%二氧化碳中。通過胰蛋白酶方法收集細胞。

1.4 載體和穩定細胞系的構建

wIDH1 或mIDH1的載體通過DNA 重組技術構建。攜帶wIDH1、mIDH1或空p-EGFP-C1載體的U87細胞系基礎上的穩定細胞系通過轉染方法分別構建，并通過G418方法最終選擇。穩轉細胞系的建立經驗證實驗（應用WB 檢測 wIDH1、mIDH1 的表達）確定，篩選成功表達wIDH1或mIDH1蛋白的細胞系。

1.5 細胞增殖和活力測定

為了檢測三種細胞系的增殖能力，使用胰蛋白酶消化和細胞計數方法。將相同數量的細胞在常規條件下培養48 h，然后通過胰蛋白酶方法收集并在細胞計數板上計數。通過最終細胞數與初始細胞數的比率計算增殖率。增殖抑制率的檢測基于CCK-8 方法。將細胞以2×10個細胞/ 毫升（100 微克/孔）的密度接種在96 孔板中，使其生長48 h，使零劑量細胞生長48 h，作為相應的對照組。在實驗結束時，向培養基中加入10 μL CCK-8 液體，將細胞培養 4 h。在 450 nm 處測量吸光度。細胞的增殖抑制率通過（1―Acontrol/A 替莫唑胺）×100%來評估。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

流式細胞術用于評估細胞凋亡。用400 μmol/L 替莫唑胺處理細胞72 h。將未經替莫唑胺處理的細胞作對照組。然后，收集細胞并用膜聯蛋白V-FITC 凋亡檢測試劑盒（Keygen Biotech）處理。將細胞用PBS洗滌3次并重懸于400 μL 結合緩沖液中，然后在室溫下在黑暗中與 5 μL 膜聯蛋白 V-FITC 和 5 μL PI 一起溫育 15 min。最后，使用流式細胞術（Gallios，Beckman-coulter，USA）在1 h內檢測細胞凋亡。

1.7 Transwell 細胞侵襲實驗

實驗步驟：①基質膠準備：將凍存于-80°C冰箱的BD matrigel 4°C過夜，變成液態；②取300 μL 無血清培養基，加入60 μL 每室Matrigel ，混勻，4 ℃操作；放入37 ℃培養箱中，孵育5 h。③消化細胞，無血清培養基洗3 次，計數，配成細胞懸液；④用無血清培養基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100 μL細胞懸液；⑤下腔室中加入500 μL含有20%FBS條件培養基；⑥37 ℃培養箱中，孵育24 h；⑦取出transwell 用PBS 洗2 遍，5%戊二醛固定，4 ℃；⑧結晶紫（0.1%）染色，室溫0.5 h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白質印跡分析

將細胞在冰冷的RIPA 裂解緩沖液中裂解。根據制造商的方案使用Bio-Rad 蛋白質測定法估計蛋白質濃度。通過SDS-PAGE 分離細胞裂解物并轉移到PVDF膜上。將印跡在含有5%脫脂奶粉的TBS緩沖液中在室溫下封閉1 h。將膜在4 ℃下與第一抗體一起溫育過夜。洗滌膜并與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體在室溫下孵育1 h，洗滌。在每次用抗體處理后，用含有Tween20的tris緩沖鹽水充分洗滌膜。根據制造商的說明，通過增強的化學發光進行抗體結合的檢測。使用發光圖像分析儀進行數據收集和處理。剝離相同的印跡并用抗β-肌動蛋白或抗GAPDH重新探測以用作內部對照。

1.9 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞凋亡蛋白的表達

采用ELISA 法將樣本加入預冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。吸取勻漿液到離心管，4 ℃、5 000×

g

離心5～10 min，取上清，-20 ℃或-80 ℃保存，避免反復凍融。按照說明書中操作步驟對三組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bax）表達水平進行測定。

2 結果

2.1 mIDH1 顯著增加對替莫唑胺的化學敏感性

在細胞集落形成測定中，wIDH1 組、對照組和mIDH1 組之間細胞增殖差異無統計學意義（

P

＞0.05）。將 wIDH1 組、對照組和 mIDH1 組細胞暴露于替莫唑胺72 h，以評估其化學敏感性。結果顯示，mIDH1 組U87 細胞在CCK-8 測定中顯示出對替莫唑胺的敏感性，mIDH1 組細胞增殖和細胞活力較wIDH1組和對照組低，差異有統計學意義（

P

＜0.05）。見表1。

表1 細胞活力測定/

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡

流式細胞術檢測400 μmol/L 替莫唑胺處理后mIDH1 組與其他組細胞凋亡的差異，結果表明mIDH1 組細胞凋亡率（62.18±3.47）%高于對照組（33.16±6.54）%和wIDH1組（15.36±2.33）%，表明IDH1 R132H 突變增加對替莫唑胺的化學敏感性（

F=

11.147，

P=

0.003）。

2.3 細胞侵襲實驗

mIDH1 組細胞侵襲能力低于對照組和wIDH1 組，三組中wIDH1 組細胞侵襲能力最強。表明IDH1 R132H 突變增加對替莫唑胺的化學敏感性。見圖2。

圖2 細胞侵襲實驗（HE×100）：A為野生IDH1基因（wIDH1）組；B為對照組；C為突變IDH1基因（mIDH1）組

2.4 細胞凋亡蛋白的表達變化

為了研究mIDH1，wIDH1 和替莫唑胺誘導的細胞凋亡的潛在機制，應用蛋白質免疫印跡分析相關分子的蛋白質變化。結果顯示，三組不同處理中，mIDH1 組在Caspase-3，Caspase-9 和 Bax 中的蛋白表達水平最高，Bcl-2 的蛋白表達水平最低（

P

＜0.05），wIDH1 的異位過表達顯示出化療抗性特征或至少誘導Bcl-2 蛋白表達水平的上調和 Caspase-3，Caspase-9 和 Bax 蛋白水平的下調。表明wIDH1 可能在化療耐藥中起輔助作用。mIDH1 通過下調Bcl-2 水平和上調體內和體外Caspase-3，Caspase-9 和Bax 水平來增強對膠質瘤細胞的化療敏感性，表明mIDH1 可能作為化療增強靶標起作用。見圖3，表2。

圖3 蛋白質免疫印跡

表2 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bax）和B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的蛋白表達水平/

2.5 ELISA 檢測細胞凋亡蛋白的表達

mIDH1 組在三組中Caspase-3，Caspase-9 和Bax 中的表達水平最高，Bcl-2 的表達水平最低（

P

＜0.05），wIDH1 的異位過表達誘導Caspase-3，Caspase-9 和Bax 水平的下調以及Bcl-2表達水平的上調（

P

＜0.05）。見表3。

表3 酶聯免疫吸附測定檢測細胞凋亡蛋白的表達/

2.6 mIDH1 增強體內替莫唑胺抗腫瘤功效

所有注射接受的小鼠最終形成膠質瘤模型，用替莫唑胺處理，每個神經膠質瘤腫塊的大小在第21天結束時測量，發現增殖結果與體外相似。mIDH1 腫瘤生長比wIDH1 組和對照組慢得多。與其余兩組相比，mIDH1 組的腫瘤體積（220.17±12.15）mm最?。?p>P

＜0.05）。 wIDH1 組（624.36±33.54）mm與 對 照 組（601.17±36.18）mm差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

2.7 mIDH1 提高替莫唑胺干預敏感性

體內研究顯示，同時注射膠質瘤細胞和替莫唑胺胃管灌注處理裸鼠時，wIDH1 組腫瘤形成抑制率最低（41.37±5.43）%，mIDH1 組腫瘤形成抑制率最高（82.14±5.38）%，對照組為（52.16±3.17）%。在替莫唑胺治療組中，mIDH1組總有效率為（73.15±8.46）%，wIDH1組總有效率為（22.16±3.96）%。對照組為（42.25±3.17）%。結果表明，wIDH1的過表達可能在體內提供化療耐藥性，而mIDH1可能提高化療敏感性。

3 討論

惡性膠質瘤目前與預后不良相關，盡管采用多模式治療策略，復發仍然幾乎不可避免。膠質瘤在組織學上分級為Ⅰ～Ⅳ，70%～90%的Ⅱ～Ⅲ級膠質瘤和繼發性Ⅳ級膠質母細胞瘤在一個IDH1 等位基因中含有突變，其中 R132H 是最常見的。IDH1 存在于細胞質和過氧化物酶體中，在那里它將異檸檬酸轉化為α-KG。然而，突變酶將α-KG 轉化為代謝物D-2-羥基戊二酸，其結構類似于α-KG 和α-KG 依賴性雙加氧酶的競爭性抑制劑。治療膠質瘤通常包括手術切除，放射治療和使用DNA 烷化劑替莫唑胺的化療。替莫唑胺的細胞毒性作用主要通過產生 O-6-甲基鳥嘌呤（O6meG）病變來介導。如果甲基不被O6meG-DNA 甲基轉移酶（MGMT）除去，這是一種與替莫唑胺抗性相關的酶，O6meG 在DNA 復制過程中與胸腺嘧啶錯配，導致無效的錯配修復和持續的G2 檢查點停滯，隨后細胞凋亡或衰老。MGMT啟動子甲基化和因此低MGMT表達在IDH1 突變體膠質瘤中是典型的，但不是唯一的，其通常對替莫唑胺的反應優于它們的IDH1 野生型對應物。然而，MGMT 表達不是替莫唑胺敏感性的唯一決定因素，IDH1突變體和野生型膠質瘤具有不同的分子個體發育，使得IDH1 突變體和野生型膠質瘤之間的比較沒有信息，哪些腫瘤特征可以直接歸因于IDH1 突變。缺乏IDH1 突變的Ⅱ～Ⅲ級神經膠質瘤在遺傳上與IDH1 突變神經膠質瘤不同，并且與原發性Ⅳ級膠質母細胞瘤更相似。雖然遺傳改變如EGFR擴增和CDKN2A缺失在IDH1 WT膠質瘤中很常見，但它們很少發生在具有突變IDH1的膠質瘤中。盡管被認為化學反應性IDH1 突變膠質瘤通常在手術切除和放射治療和替莫唑胺治療后仍然復發，但突出了對新治療方案的需求。

本研究發現mIDH1 在生物學行為和化療敏感性方面表現出不同。本研究證明mIDH1 引起增殖抑制并上調化療敏感性，其增強了替莫唑胺引起的細胞增殖和細胞凋亡的抑制作用。wIDH1 過表達不促進細胞增殖，但在替莫唑胺誘導的凋亡抑制中表現出化療耐藥特征。由于這些差異，膠質瘤可分為兩種亞型，這兩種亞型存在明顯不同的預后。重要的是要了解這些差異并探索由mIDH1 誘導的相對更好的預后的機制。筆者認為腫瘤病人的預后取決于腫瘤細胞本身以及對其進行的治療。前者涉及多因素事件，包括細胞周期、細胞凋亡等。細胞凋亡是程序性細胞死亡過程，其可由一些內源性或外源性因子誘導，即死亡信號誘導的死亡受體介導的途徑和線粒體依賴性途徑。細胞凋亡對于維持細胞數量的穩態非常重要。Caspase-cascade在細胞凋亡中至關重要。Bax/Bcl-2 的比例通常決定細胞凋亡和激活的半胱天冬酶級聯反應。mIDH1和wIDH1 過度表達在常規條件下不會引起細胞凋亡，wIDH1 過表達抑制替莫唑胺誘導的細胞凋亡，其是通過降低Bax/ Bcl-2 比率和Caspase-3 活性。故而，mIDH1 異位表達通過增加Bax/ Bcl-2 比率和Caspase-3 活性來增強細胞凋亡。筆者推測，其機制與mIDH1下調膠質瘤細胞MMP-2、MMP-9體內外表達水平，從而降低腫瘤細胞侵襲能力有關。

綜上所述，mIDH1 引起膠質瘤細胞的生物學變化，這減少了細胞的惡性行為。mIDH1 還在體內和體外增強膠質瘤細胞的化療敏感性，而wIDH1 顯示出化療抗性特征。mIDH1 通過上調替莫唑胺后膠質瘤細胞 Caspase-3、Caspase-9、Bax 表達并下調Bcl-2表達提高膠質瘤細胞凋亡率，增強治療敏感性。