磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑微生物限度檢查方法的建立

李敏，龔亞，曹健，邢茂

磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑為陸軍軍醫大學第二附屬醫院的自制制劑［中國人民解放軍中央軍委后勤部衛生局非標準制劑，批準文號：總制字（2018）F705015］，其主要成分為磺胺嘧啶、魚肝油，用于治療鼻黏膜糜爛性潰瘍，鼻中隔手術后促進肉芽生長，加速傷口愈合，并有潤滑鼻黏膜的作用。根據《中國藥典》（2015 年版）規定，對含抑菌成分的制劑進行微生物限度檢查時，應先消除供試品相應成分的抑菌活性，再依法進行檢查，以保證方法的適用性。該制劑因含有磺胺類抑菌成分，無法通過簡單一種方法進行試驗，因此需要采用多種方法進行研究及比較，并選取最優且符合中國藥典標準的方法進行其微生物限度檢查。本研究擬通過采用平皿法、培養基稀釋法和中和法，降低或消除其抑菌作用，建立磺胺類藥物科學的微生物限度檢查方法。也為其他有類似抑菌性的藥品建立微生物限度方法學驗證提供相應的借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP-Ⅱ型架盤天平（上海醫用激光儀器廠）；LRH-70 型生化培養箱（上海一恒科技有限公司）；M0ST-T24-B 型臺式滅菌器（山東新華有限公司）；CS101-2ABN 型電熱鼓風干燥箱（重慶永生有限公司）；BSC-1000-Ⅱ-A2 型生物安全柜（蘇州華宇有限公司）。

1.2 供試品

磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑（批次190422，190730，191223），為陸軍軍醫大學第二附屬醫院自制。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］由中國食品藥品檢定研究院菌種保藏中心提供，均為1代冷凍保存菌株；黑曲霉［CMCC（F）98003］由北京三藥科技提供，為4代冷凍保存菌株。

1.4 培養基、試劑及稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批次180427）、胰酪大豆胨液體培養基（批次171218）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批次170316）、沙氏葡萄糖液體培養基（批次161118）、麥康凱液體培養基（批次170313）、麥康凱瓊脂培養基（批次171211）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批次181227）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批次180326）均購自北京陸橋有限公司，經過適應性試驗驗證符合《中國藥典》2015 年版四部規定；聚山梨酯-80（成都市科隆化學品有限公司，批次2017091901）、對氨基苯甲酸（上海化學試劑總廠，批次82-12-01）；稀釋液為0.9 %氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批次M18050704）。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備

取磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑10 mL，加入10 mL 聚山梨酯-80，用稀釋液逐級稀釋制成1∶10、1∶100供試液。

2.2 菌液的制備

按照《中國藥典》2015 年版四部通則1105 和1106 中規定的菌液制備方法，制成適宜濃度的各菌懸液。

2.3 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法的適用性試驗

取上述磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑供試液9.9 mL 于滅菌試管中，加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，使供試液中含試驗菌不大于100 cfu/mL，同法制備含銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉不大于100 cfu/mL 的供試液。平皿法：分別取各供試液1 mL，置無菌平皿中，每皿1 mL；培養基稀釋法：分別取供試液1 mL，置2 個或5 個無菌平皿中，使每皿 0.5 mL 或 0.2 mL。注入 15～20 mL 溫度不超過45 ℃熔化的瓊脂培養基，混勻，凝固。胰酪大豆胨瓊脂培養基于32.5 ℃培養2 d，作需氧菌計；沙氏葡萄糖瓊脂培養基于22.5 ℃下培養3 d，作霉菌和酵母菌計，作為試驗組。供試品對照組以稀釋液代替菌液，菌液對照組以稀釋液代替供試液，乳化劑對照組以聚山梨酯-80 代替供試品，其余均同試驗組操作。每株試驗菌平行制備兩組。該操作在C級背景下的A級單向流空氣區域內進行。

磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑的三個不同批次進行試驗，計算回收率：試驗組的回收率=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數；乳化劑對照組的回收率=乳化劑對照組平均菌落數/菌液對照組平均菌落數。從表1 可以看出，平皿法（1 毫升/皿）適用于磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑的霉菌和酵母菌計數檢查，但無法消除其需氧菌計數檢查中枯草芽孢桿菌的檢查；培養基稀釋法（0.2 毫升/皿）適用于磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑的需氧菌計數檢查。10%的聚山梨酯-80 不會干擾上述各菌株的生長。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌各試驗菌株的回收率（n=2）

2.4 控制菌檢查方法的適用性試驗

取1∶10 磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑供試液10 mL，及不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌菌懸液1 mL，分別加至適宜體積、含適宜濃度對氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液體培養基中，照《中國藥典》2015年版四部（通則）1106項下控制菌檢查方法進行檢查，作為試驗組。供試品對照組以稀釋液代替菌液，陰性對照組以稀釋液代替供試液和菌液，陽性對照組以稀釋液代替供試液，乳化劑對照組以聚山梨酯-80 代替供試品，其余均同試驗組操作；中和劑對照組以含適宜濃度對氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液體培養基代替胰酪大豆胨液體培養基，其余同陽性對照組操作。該操作在C級背景下的A 級單向流空氣區域內進行。

如表2 所示，磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑的控制菌檢查中銅綠假單胞菌采用直接接種法、培養基稀釋法（200 mL）、中和法（0.5%對氨基苯甲酸，下同）可檢出，大腸埃希菌采用培養基稀釋法（400 mL）、中和法可檢出，金黃色葡萄球菌采用中和法可檢出。綜合上述結果，控制菌檢查采用中和法適用于磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑的控制菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌檢查，且乳化劑及中和劑對3種菌種均無毒性。

表2 控制菌檢查的適用性試驗結果

3 討論

《中國藥典》2015 年版規定，微生物限度檢查應在不低于D 級背景下的B級單向流空氣區域內進行，本試驗在C 級背景下的A 級單向流空氣區域內操作；鼻用制劑可接受的最大需氧菌總數為200 cfu/mL，最大霉菌和酵母菌總數為20 cfu/mL，即需氧菌、霉菌和酵母菌計數檢查時供試品稀釋級分別高于1∶200、1∶20 時無意義。本品為磺胺類藥物，抗菌譜廣，對大多數細菌如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等有良好的抗菌活性，試驗中通過稀釋供試品的方法無法消除其抑菌活性。當供試品因其抑菌活性無法選擇最低稀釋級的供試液進行方法適用性試驗時，應采用適宜的方法對供試液進一步處理。如果供試品對微生物的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適用性試驗。前期試驗證明，薄膜過濾法對于混懸劑適用性差，易造成薄膜堵塞。

本試驗采用平皿法無法消除該藥對需氧菌中枯草芽孢桿菌的抑菌作用，采用培養基稀釋法可消除其抑菌活性，各菌株的回收率均符合規定。本品對真菌的抗菌活性較弱，結果證明，采用平皿法試驗，白色念珠菌和黑曲霉的回收率范圍在0.5～2.0，即進行霉菌和酵母菌計數檢查時可采用平皿法進行適用性試驗。本品對銅綠假單胞菌的抑制作用相對較弱，故控制菌檢查采用直接接種法即可進行銅綠假單胞菌的適用性檢查，但不適用于大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的檢查。根據中國細菌耐藥監測網數據，磺胺類藥物對大腸埃希菌耐藥率高于50%，而對金黃色葡萄球菌（包括甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌）耐藥率低于20%，因此通過培養基稀釋法，培養基體積增大到400 mL時可消除其對大腸埃希菌的抑制作用，但即使體積增加至1 000 mL 時，也無法消除其對金黃色葡萄球菌的抑制作用。磺胺類藥物主要通過與對氨基苯甲酸競爭性結合二氫蝶酸合成酶，阻斷細菌葉酸的合成而干擾細菌生長繁殖，這種抑菌作用可被對氨基苯甲酸逆轉，且這種逆轉作用呈現濃度依賴性。本研究對中和劑對氨基苯甲酸的濃度進行了篩選，將供試品接種至含0.5%對氨基苯甲酸的胰酪大豆胨液體培養基100 mL，可消除本品對控制菌金黃色葡萄球菌的抑制作用。經驗證，此法同樣適用于控制菌大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的適用性檢查。

因此，微生物計數檢查中需氧菌計數采用培養基稀釋法，霉菌及酵母菌采用平皿法；控制菌檢查采用中和法，適用于磺胺嘧啶魚肝油滴鼻劑微生物限度檢查。本試驗所建立的方法簡單可行，結果準確有效，為其他磺胺類藥物微生物限度檢查方法的建立提供參考。