釀酒原料及白酒中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的測定方法優化

任 璐，燕玲娟，羅冠龍，桑 濤，劉麗麗

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西寶雞 721400）

真菌毒素是產毒真菌在一定環境條件下產生的次級代謝產物，廣泛污染農作物、食品及飼料等植物源性產品[1]。可引起人類和動物急性或慢性中毒，部分已被證實具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致”作用。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OA 或OTA)是一種強力的肝臟毒素和腎臟毒素，并有導致畸形、突變和致癌作用，為此國際癌癥研究機構IARC 將其定為ⅡB 類致癌物[2]。玉米赤霉烯酮（Zearalenone 或ZON）是一種特殊毒性的生物毒素，具有類雌激素樣作用，能引起動物流產、死胎、返情等生殖機能異常，還可以導致生長下降、免疫抑制、不育、畸形等[3]。為此，嚴格控制食物及制品中這兩種真菌毒素物質的含量，對保障消費者身心安全十分重要。

對于谷物及酒類中赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的檢測方法多為采用免疫親和柱層析凈化手段，進行熒光光度法和高效液相色譜法[4-5]、酶聯免疫吸附法[6]、液相色譜-質譜法[7-8]。目前采用液相色譜-質譜法已是檢測趨勢，因為該方法檢測限低、精密度高，本研究采用高效液相色譜-質譜聯用技術進一步優化，使得方法檢測限更低，更有利于釀酒原料及白酒品質的把控，保障白酒安全。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品：原料（高粱、大麥、小麥）、成品酒取自于陜西西鳳酒股份有限公司。

試劑：甲酸、乙腈、甲醇、乙酸銨（分析純）、超純水、氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、濃鹽酸、TritonX-100。

儀器設備：高效液相色譜串聯質譜儀（島津公司HPLC-20A 高效液相色譜儀串聯LCMS-8045 質譜儀），萬分之一天平（梅特勒-托利多公司），氮吹儀（天津奧特賽恩斯），OTA 免疫親和柱和ZON 免疫親和柱（德國拜發），高速均質器（德國IKA）。

標準品：赭曲霉毒素A（OTA 純度≥98%，Pribo公司），玉米赤霉烯酮（ZON 純度≥98 %，Pribo 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取

原糧：準確稱取粉碎后的釀酒原糧5 g于50 mL離心管中，加入20 mL提取液a渦旋混勻，靜置30 min后高速均質3 min，5000 r/min 條件下離心15 min。準確移取上清液6 mL，加入稀釋溶液b X mL，混勻后過玻璃纖維濾紙。收集濾液c，待凈化。

白酒：準確吸取6 mL 白酒試樣，加入稀釋溶液b X mL，混勻后過玻璃纖維濾紙，收集濾液c，待凈化。OTA和ZON提取區別見表1。

1.2.2 樣品凈化

原糧：待免疫親和柱保護液流凈后，取待凈化濾液c Y mL，以自然重力流速通過免疫親和柱，流完后加10 mL 淋洗液d 過疫親和柱，再用5 mL 超純水淋洗，自然重力流干后擠干小柱。準確加入1.5 mL 純有機試劑e 洗脫，再加入1.5 mL 超純水洗脫，擠干小柱，收集兩次洗脫液于同一試管中，待上機。白酒凈化條件同原糧一樣，具體凈化參數見表1。

表1 OTA和ZON的提取、凈化參數

1.2.3 標準儲備液和工作液

標準儲備液：分別稱取OTA 和ZON 各1.0 mg，OTA 用甲醇-乙腈（1+1）溶解并定容至10 mL，ZON用乙腈定容至10 mL，分別得到0.1 mg/mL 的OTA和ZON標準儲備液，-18 ℃下避光保存。

OTA系列標準工作液：移取赭曲霉毒素A標準儲備液0.1 mL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇-乙腈（1+1）定容，配成100 ng/mL 的OTA 中間標準液。再分別移取OTA 中間標準液5 mL、2 mL、1 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.05 mL 至10 mL 容量瓶中，用提取液定容，分別配成濃度為50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5.0 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL 的系列標準工作液，4 ℃下避光保存。

ZON 系列標準工作液：準確移取玉米赤霉烯酮標準儲備液1 mL 至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配成1 μg/mL 的玉米赤霉烯酮中間標準液。再分別移取中間標準液2 mL、1 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.05 mL、0.01 mL、0.005 mL至10 mL容量瓶中，用提取液定容，分別配成濃度為200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL的系列標準工作液，4 ℃下避光保存。

1.2.4 儀器參數條件

液相條件：色譜柱為Shin-pack XR-ODSIII C18(2.0 mm I.D *150 mm L.,3.0 μm)；OTA 的流動相A為0.1 %甲酸-5 mmol/L 乙酸銨，B 為乙腈；ZON 的流動相A 為超純水，B 為乙腈；進樣量都為10 μL；柱溫OTA 和ZON 分別為30 ℃、40 ℃；流速分別為0.2 mL/min、0.3 mL/min，洗脫方式：梯度洗脫，分別見表2、表3。

表2 OTA洗脫梯度

表3 ZON洗脫梯度

質譜條件：兩種物質質譜檢測條件基本一致，檢測方式都為多級反應監測（MRM）掃描；離子源：ESI，負離子掃描模式；OTA 和ZON 檢測加熱塊溫度分別為：400 ℃、350 ℃；DL 溫度：250 ℃；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：10 L/min；駐留時間：100 ms。

2 結果與討論

2.1 液相、質譜條件的選擇和優化

流動相不僅運載樣品，而且對于物質的分離、響應至關重要。經過試驗最終選擇ZON 流動相為乙腈和超純水，OTA 流動相為乙腈、0.1 %甲酸-5 mmol/L 乙酸銨。這兩種物質都采用ESI 負離子的多級檢測模式，OTA 和ZON 的定量離子對分別為：402.10＞358.10、317.20＞175.05，其所得的MRM 色譜圖和相對應的質譜圖分別如圖1、圖2所示。

圖1 OTA的MRM色譜圖和相對應的質譜圖

圖2 ZON的MRM色譜圖和相對應的質譜圖

2.2 線性范圍

將OTA 和ZON 系列標準工作液按照1.3 分析條件進行測定，外標法定量。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制校準曲線，如圖3、圖4 所示。OTA 曲線方程為Y=28038.5X+178.601，相關系數r=0.9999，線性關系良好，方法檢出限＜0.1 ng/mL。ZON曲線方程為Y=55726.9X+1919.47，相關系數r=0.9999，線性關系良好；方法定量限為0.05 ng/mL，檢出限＜0.01 ng/mL，低于國標檢測方法。

圖3 OTA標準曲線

圖4 ZON標準曲線

2.3 精密度試驗

對不同濃度的標準工作液，分別連續測定6次，考察儀器的精密度，檢測濃度重復性結果如表4。結果顯示，不同濃度的OTA 和ZON 標準品相對標準偏差（RSD%）在0.67 %～1.68 %之間，儀器精密度良好。

表4 濃度重復性結果(n=6)

2.4 回收率試驗

在釀酒原糧及白酒中分別加入一定量的OTA和ZON 中間標準液，得到不同濃度的樣品，再根據1.4 的方法進行樣品處理，測定其回收率，樣品回收率的計算為：(3×檢測值-本底值)/加標值，檢測結果如表5。在釀酒原糧（高粱、大麥、小麥）及白酒中，OTA 的回收率都在83.76 %～110.04 %之間，完全符合檢測要求；在高粱中ZON 的回收率稍大于120%，這與高粱自身的基質有關系，采用質譜檢測器，存在基質增強效應；在小麥、大麥、白酒中，ZON的回收率均≤110.04%，符合檢測要求。

表5 回收率試驗結果

3 結論

本研究采用三重四級桿液質聯用儀建立了釀酒原料及白酒中赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的檢測方法。樣品經提取液提取后過免疫親和柱凈化，收集凈化液上機檢測。結果表明，OTA 和ZON在一定范圍內線性關系均良好，r＞0.9999，方法檢出限均較低（＜0.1 ng/mL），在原糧與白酒中回收率主要集中在83.76 %～110.04 %之間，ZON 在高粱中的回收率為122%左右，這主要是高粱基質對MS 檢測器的增強效應所致。此方法操作相對簡便、快捷，完全符合企業準確檢測的需要。