大麻二酚對(duì)口腔頜面部炎性痛的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究

宋賢奎 謝冠博 吳寧 李錦 韓笑 郭紅延

口腔頜面部常見的炎癥性疾病均會(huì)導(dǎo)致急慢性疼痛，目前針對(duì)這些疾病的鎮(zhèn)痛藥物通常為非甾體類鎮(zhèn)痛藥，但用藥后有可能引發(fā)胃腸刺激、胃潰瘍、肝腎異常、出血傾向和心血管損害等不良反應(yīng)［1］，使其在長(zhǎng)期使用或特殊人群中的使用受到限制。由此，尋找新的抗炎鎮(zhèn)痛替代藥物尤為必要。

大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻提取物中一種無精神活性的化合物，有研究表明其參與情緒調(diào)節(jié)、抗驚厥、抗炎、鎮(zhèn)痛以及免疫調(diào)節(jié)等過程［2］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在足底炎性痛模型中CBD具有鎮(zhèn)痛作用［3］，但其對(duì)于頜面部炎性痛的作用尚未見報(bào)道。口腔頜面部與軀體四肢部位的疼痛傳導(dǎo)通路不同，三叉神經(jīng)脊束核是頜面部疼痛信息傳導(dǎo)至中樞的第一個(gè)核團(tuán)，疼痛信息的傳導(dǎo)與其尾側(cè)亞核密切相關(guān)［4］。

本實(shí)驗(yàn)以布洛芬（IBU）作為陽(yáng)性對(duì)照藥，利用小鼠口腔頜面部福爾馬林致炎性痛模型，評(píng)價(jià)CBD對(duì)于頜面部炎性痛的鎮(zhèn)痛作用，并進(jìn)一步研究其發(fā)揮作用的可能神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，以期為臨床上相關(guān)疼痛的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡雄性SPF級(jí) C57BL/6J小鼠，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（質(zhì)量合格證號(hào) No.110324200102581774，No.110324200102925735）。恒溫（23±1）℃、12 h明/暗燈光循環(huán)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。

1.2 口腔頜面部炎性痛模型建立

模型小鼠在右側(cè)鼻旁唇部觸須墊皮下注射1%福爾馬林溶液30μL，之后將其單只放入20 cm×15 cm×20 cm聚乙烯透明觀察盒中進(jìn)行觀察，觀察盒后放置觀察鏡。將45 min平均分為15個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段時(shí)長(zhǎng)為3 min，其中0～6分鐘即為一相痛，12～45 min即為二相痛。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

選取40只 C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照（control）、模型（model）、CBD 30 mg/kg（CBD30）、CBD 60 mg/kg（CBD60）和IBU 5組，每組8只。腹腔注射溶劑（control和 model組）、CBD 30 mg/kg（CBD 30組）、CBD 60 mg/kg（CBD 60組）、布洛芬 90 mg/kg（IBU組），1 h后鼻旁唇部觸須墊皮下注射生理鹽水（control組）或1%福爾馬林30μL；如1.2所述記錄抓臉時(shí)間。完成行為學(xué)觀察后，待小鼠在注射鹽水或福爾馬林1 h后，取對(duì)照組、模型組、CBD60、IBU這4組唇部炎性組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。另外選取24只小鼠隨機(jī)分為如上4組（n＝6），同樣進(jìn)行疼痛反應(yīng)行為學(xué)觀察，完成觀察后，在注射生理鹽水或福爾馬林2 h后取腦，進(jìn)行免疫熒光染色。

1.4 RT-qPCR

唇部炎性組織剪碎后加入1 mL TRIzol，進(jìn)行組織破碎。按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。測(cè)濃度后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA（42℃15 min、95℃3 min）。按照熒光定量PCR試劑盒說明書配制20μL熒光定量PCR體系，在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中運(yùn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為95℃5 min；95℃10 s，60℃40 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如表 1。以2－ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 RT-qPCR引物序列Tab 1 Sequences of the primers for RT-qPCR

1.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

待取材小鼠以70 mg/kg戊巴比妥鈉生理鹽水溶液腹腔注射進(jìn)行麻醉后以生理鹽水和4%多聚甲醛溶液灌流，將完整腦部取出后以4%多聚甲醛溶液固定4 h，換30%蔗糖水溶液4℃脫水24 h，進(jìn)行冰凍切片。室溫封閉1 h（0.3%triton x-100、5%BSA、PBS溶液），抗c-Fos抗體（1∶400）4℃孵育過夜，二抗（1∶500）避光室溫孵育1 h。以熒光顯微鏡拍攝腦片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 小鼠福爾馬林口腔頜面部疼痛模型建立

模型組小鼠的抓臉時(shí)間呈現(xiàn)經(jīng)典的兩相痛反應(yīng)：在6 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)快速且密集的抓臉行為，該時(shí)程反應(yīng)為一相痛；12～45 min小鼠再次表現(xiàn)出密集的抓臉行為，該時(shí)程反應(yīng)為二相痛。雙因素方差分析顯示，處理（F［1，14］＝273，P＜0.001）、時(shí)間（F［5，74］＝7.28，P＜0.001）以及兩者的交互作用（F［14，196］＝6.62，P＜0.001）均對(duì)抓臉時(shí)間有顯著影響。Turkey后檢驗(yàn)顯示，模型組一相痛和二相痛的抓臉時(shí)間均明顯高于對(duì)照組（圖 1）。

圖1 唇部注射福爾馬林后小鼠抓臉時(shí)間變化（與對(duì)照組相比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）Fig 1 Face-rubbing time after injection of formalin（Compared with the control group，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）

一相痛時(shí)程中，抓臉總時(shí)間的單因素方差分析顯示處理因素顯著影響抓臉時(shí)間（F［4，35］＝9.45，P＜0.001），模型組小鼠的抓臉總時(shí)間顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），而CBD和IBU組抓臉時(shí)間與模型組相比均無顯著差異（P＝0.91，P＝0.17，圖 2A）。二相痛時(shí)程中抓臉總時(shí)間（圖2B）的單因素方差分析顯示處理因素顯著影響抓臉時(shí)間（F［4，35］＝46.5，P＜0.001）。Turkey后檢驗(yàn)顯示，模型組的二相痛抓臉總時(shí)間顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），CBD60和IBU組的二相痛抓臉總時(shí)間均顯著低于模型組（P＜0.01，P＜0.01），而CBD30組抓臉時(shí)間與模型組比無顯著差異（P＞0.99）。

圖2 各組一相痛（A）和二相痛（B）時(shí)程抓臉總時(shí)間（與對(duì)照組相比，*P＜0.001；與模型組相比，＃P＜0.01）Fig 2 The total face-rubbing times in phase 1（A）and phase 2（B）（Compared with the control group，*P＜0.001；Compared with the model group，＃P＜0.001）

2.2 唇部組織炎性因子mRNA表達(dá)變化

對(duì)不同處理組的各類炎性因子的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，模型組 IL-1β（圖 3，F(xiàn)［3，28］＝9.49，P＜0.001）、IL-6（圖 3，F(xiàn)［3，28］＝6.44，P＜0.01）、TNF-α（圖 3，F(xiàn)［3，28］＝5.10，P＜0.01）以及COX-2（圖 3，F(xiàn)［3，28］＝10.2，P＜0.001）的 mRNA表達(dá)均顯著升高，而 FAAH（圖 3，F(xiàn)［3，28］＝2.75，P＝0.25）和 15-PGDH（圖 3，F(xiàn)［3，28］＝0.311，P＝0.98）的表達(dá)無顯著變化；與模型組相比，CBD（60 mg/kg）和布洛芬均能顯著降低 IL-1β（P＜0.01，P＜0.01）、IL-6（P＜0.05，P＜0.05）、TNF-α（P＜0.05，P＜0.05）以及 COX-2（P＜0.05，P＜0.05）的 mRNA表達(dá)，而且CBD（60 mg/kg）還能降低 FAAH的 mRNA表達(dá)（P＜0.05）；各組中15-PGDH的表達(dá)未表現(xiàn)出顯著差異（P＝0.99，P＝0.96）。

圖3 唇部炎性組織 mRNA表達(dá)（與對(duì)照組相比，**P＜0.01；***P＜0.001；與模型組相比，＃P＜0.05；＃＃P＜0.01）Fig 3 The mRNA expression in inflammatory lip tissue（Compared with the control group，**P＜0.01，***P＜0.001；compared with the model group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01）

2.3 三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核（sp5c）c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量變化

本實(shí)驗(yàn)中首先觀察了各組小鼠的疼痛行為反應(yīng)，結(jié)果同2.1，在此未重復(fù)展示。通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到與對(duì)照組相比（圖4），模型組sp5c淺層有大量c-Fos表達(dá)（圖4）。腹腔給予CBD 60 mg/kg后sp5c的c-Fos表達(dá)明顯降低（圖4，CBD60組），而給予布洛芬后無此現(xiàn)象（圖4，IBU組）。對(duì)c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，單因素方差分析顯示（圖 5，F(xiàn)［3，20］＝22.9，P＜0.001，n＝6），模型組的 c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），CBD60組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著低于模型組（P＜0.05），而IBU組與模型組沒有顯著差異（P＝0.39）。

圖4 各組鹽水或福爾馬林注射后2 h sp5c中c-Fos的表達(dá) （免疫熒光，×10）Fig 4 The expression of c-Fos in sp5c 2 h after injection of saline or formalin （Immunofluoresence，×10）

與對(duì)照組相比，*P＜0.001；與 model組相比，＃P＜0.05圖5 c-Fos表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果Compared with the control group，*P＜0.001；compared with the model group，＃P＜0.05Fig 5 The statistical result of c-Fos expression

3 討 論

在口腔臨床工作中，牙周炎、牙髓炎、癤癰、黏膜炎等均是常見的口腔頜面部炎性疾病，伴隨這些疾病的通常是非常令人不快的疼痛感，而緩解與之相關(guān)的疼痛是患者和臨床工作者的共同目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中CBD（60 mg/kg，i.p.）能夠顯著降低福爾馬林致炎后的小鼠抓臉時(shí)間，提示CBD對(duì)于頜面部炎性痛的鎮(zhèn)痛具有良好的藥效學(xué)作用。

炎性因子對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)展有誘導(dǎo)促進(jìn)作用，它們由活化的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌［1］。IL-1β是由單核巨噬細(xì)胞分泌的［5］，能夠通過激活 IL-1R1受體來增加TRPV1表達(dá)，進(jìn)而提高熱敏感性［6］。IL-6能夠通過誘導(dǎo)前列腺素產(chǎn)生［7］、增加TRPV1、TRPA1表達(dá)［8］而引起炎性痛。TNF-α是重要的炎性介質(zhì)之一［9］，誘導(dǎo)炎性痛是通過TNFR1受體和前列腺素介導(dǎo)的［10］，還能夠通過 p38 MAPK介導(dǎo)的 Nav1.8和Nav1.9鈉離子通道磷酸化快速調(diào)節(jié)疼痛感受器的敏感性［11-12］。本實(shí)驗(yàn)中，CBD和布洛芬均能夠顯著降低IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)。提示CBD與布洛芬均能夠通過下調(diào)炎癥因子水平發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)口腔頜面部的抗炎鎮(zhèn)痛作用。

環(huán)氧合酶COX-2是一種能由促炎因子、內(nèi)毒素和致癌基因刺激增加的誘導(dǎo)型酶，能夠促進(jìn)前列腺素的合成［13］。15-羥基前列腺素脫氫酶（15-PGDH）是前列腺素降解的關(guān)鍵酶，能夠與COX-2協(xié)同調(diào)節(jié)前列腺素的含量［14］。本實(shí)驗(yàn)中，CBD和布洛芬均能夠降低COX-2的mRNA表達(dá)，而15-PGDH的mRNA表達(dá)未受顯著影響。提示兩者可能通過減少前列腺素的合成而降低炎性反應(yīng)和疼痛反應(yīng)。

有研究表明，內(nèi)源性大麻素水平的升高能夠起到鎮(zhèn)痛作用［15］，且內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)CB1受體的激活能夠發(fā)揮突觸前抑制，進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［16］。由于直接激動(dòng)CB1可能會(huì)導(dǎo)致精神活性，抑制內(nèi)源性大麻素水解酶脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）來增加內(nèi)源性大麻素含量可能是一種既能強(qiáng)化內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)作用、又能避免精神活性的用藥策略［16］。CBD是CB 1受體的負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑［17］，且作為FDA批準(zhǔn)的上市藥物具有良好的臨床安全性［18］。本實(shí)驗(yàn)中CBD能夠顯著減少FAAH的mRNA表達(dá)，提示CBD可能通過增加內(nèi)源性大麻素含量影響內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，而IBU無此作用。

sp5c的淺層是頜面部疼痛傳入通路的重要中繼站［4］。口腔頜面部疼痛信息通過三叉神經(jīng)向中樞傳輸［19］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CBD能夠顯著降低sp5c核團(tuán)c-Fos表達(dá)，而IBU無此作用，提示CBD能夠通過降低sp5c的神經(jīng)元激活，抑制疼痛上行傳導(dǎo)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

總之，通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CBD能夠降低小鼠口腔頜面部炎性痛，其可以通過下調(diào)炎性因子發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用；且與布洛芬相比，CBD可能通過抑制sp5c神經(jīng)元的激活而阻礙疼痛上行傳導(dǎo)、以及通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。且在本實(shí)驗(yàn)劑量下，未觀察到任何不良反應(yīng)。綜上，CBD具有成為口腔頜面部炎性痛鎮(zhèn)痛藥物的潛力，本實(shí)驗(yàn)也為副作用更小的鎮(zhèn)痛藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。