青島市5歲低齡兒童重度齲患者齦上菌斑微生物群落的宏基因組學研究

劉夢佳 滕飛 公文 徐穎婕 叢蓓蓓 王萬春

美國兒童牙科學會將低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）定義為72個月以下的兒童的任何1顆及1顆以上乳牙齲壞或因齲導致的牙齒缺失或充填。中國第四次口腔流行病學調查顯示5歲兒童患齲率為71.9%，比十年前上升了 5.9%［1］。ECC是最常見的兒童口腔疾病，嚴重影響兒童的身心健康［2－3］。因此，針對低齡兒童齲病的病因學研究和精準的風險評估是現階段研究重點。

誘發齲病的因素較為復雜，四聯因素學說認為細菌、環境、宿主、時間都是齲病發生的必要因素。其中，細菌是最關鍵的因素。近年，隨著高通量測序技術和人類微生物組計劃的突破性進展，越來越多學者認為口腔微生物群落失衡導致齲病的發生和發展［4］，這為齲病研究提供了新思路。但是，目前的研究限制了對齲病微生物病因學研究的深度和精度［2，5］。

因此，本研究旨在對比解析青島市5歲重度低齡齲兒童及健康者齦上牙菌斑微生物群落差異，探究齲病發生的微生物病因學機制，甄選潛在的齲病相關微生物因子，建立基于菌群信息的齲病風險模型，為青島市兒童齲病特定目標人群微生物診斷和個性化治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2019年3～6月對青島市13個幼兒園的5歲兒童進行口腔流行病學調查，經口腔檢查篩選出31例患重癥低齡兒童齲的兒童（C組：dmfs≥6）和34例口腔健康的兒童（H組：dmfs＝0）參與本研究。受試者入選標準：過去3個月未使用抗生素；牙列為乳牙列；口腔黏膜無明顯異常；無發育畸形及全身系統性疾病；未佩戴各種正畸矯治器及配件。本研究經青島大學附屬青島市口腔醫院醫學倫理委員會批準。所有受試者均取得了兒童監護人同意。

1.2 樣本采集方法

口腔檢查：選擇3名口腔專業本科以上畢業從事口腔臨床工作3年以上醫生進行檢查，檢查器械均經高溫高壓嚴格滅菌消毒。所有醫生在檢查前均接受口腔臨床檢查培訓，檢查者之間的標準一致性檢驗Kappa值均＞0.85。齲病的診斷標準參照世界衛生組織《口腔健康調查基本方法》（第5版）。

樣本采集：采樣前，根據《人類微生物組計劃程序手冊》（http：//hmpdacc.org/resources/tools＿protocols.php）和之前的研究［2］對3位口腔檢查醫生進行樣本采集培訓。2019年3～6月上午10：00～11：00收集樣本，所有受試者早晨不刷牙，采樣前2 h內不進食并輕漱口，在口腔檢查所用的簡易牙椅上進行采樣，用無菌棉簽收集全部萌出的20顆乳牙的頰舌面及面齦上菌斑，將棉簽頭剪下保存于1.5 mL離心管中，置于－20℃條件保存，在2 h之內轉移至青島市口腔醫院中心實驗室－80℃冰箱。

1.3 基因組DNA的提取、聚合酶鏈式反應（polymer-ase chain reaction，PCR）擴增及測序

使用 MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit（QIAGEN）試劑盒純化分離菌斑樣本中基因組DNA，對其16S rRNA片段上的V3－V4高變區進行基因擴增，使用KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix試劑盒進行PCR擴增，利用 Illumina Miseq PE300平臺（Illumina，Inc.，USA）進行測序。

1.4 生物信息學和統計學分析

使用IBM SPSS 26.0進行統計分析，對各組的性別分布的差異性采用χ2檢驗，檢驗水準α＝0.05，P＜0.05有統計學意義。使用 QIIME2（https：//qiime2.org）對原始數據進行質量控制和后續生物信息學分析。使用 R（v3.6.0，https：//www.r－project.org/）進行菌群統計分析。H組和C組之間的比較采用Wilc-oxon ranksum檢驗，采用Bonferroni檢驗校正法進行多重比較分析（P＜0.05為差異有統計學意義）。通過多因素方差分析（permutationa multivariate analysis of variance，PERMANOVA）考察齲病狀態和性別對微生物結構的影響程度。所用構建模型方法為隨機森林（random forest，RF）算法，模型性能通過受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）及其曲線下面積（area under the curve，AUC）進行分析。

2 結 果

2.1 H組和C組的性別分布

65例5歲兒童納入研究，其中男36例，女39例；H組中，男17例，女17例；C組中，男19例，女12例（表1）。H組和C組的性別組成無統計學差異（P＞0.05）。

表1 H組和C組的性別分布Tab 1 Sex distribution of H group and C group

2.2 齦上菌斑菌種多樣性分布

圖1可見：α多樣性指數中，Shannon和Simpson指數顯示C組顯著高于H組（P＜0.05），說明C組的物種豐富度高于H組；不同性別來源的樣本的3個α多樣性指數均不具有統計學意義（P＞0.05）。

圖1 齦上菌斑菌群多樣性分析Fig 1 Analysis of the diversity and richness of the flora in supra-gingival plaque of the subjects

2.3 基于Bray-Curtis矩陣的齦上菌斑微生物群落結構

首先，齲病狀態會顯著影響菌斑的微生物菌群結構（F＝1.73，P＜0.05），性別無影響（P＞0.05；圖2A）；其次，H組和C組的菌斑菌群結構存在明顯差異（P＜0.05），且C組的群落結構距離較遠且更為復雜，而H組的群落結構較為相似（P＜0.001；圖 2B）；最后，PCoA分析可見兩組樣本呈顯著分離（P＜0.01；圖2C）。

圖2 H組和C組齦上菌斑微生物群落結構比較Fig 2 Comparison of microbial community structure from supragingival plaque between H group and C group

2.4 基于種系發育信息的齦上菌斑微生物菌群特點

對兩組的齦上菌斑微生物相對豐度進行統計分析（圖3）。在門水平，H組和C組樣本的組成比較相似，超過98%樣本的菌斑菌群由以下5個相對豐度占比較高的門構成，包括變形菌門（Proteobateria，35.32%）、厚壁菌門（Firmicutes，28.14%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，12.95%）、放線菌門 （Actinobacteria，12.39%）、梭桿菌門（Fusobacteria，9.57%）。

圖3 齦上菌斑菌群中優勢細菌門構成Fig 3 The predominant phylum in the supragingival plaque microbiota

在門、綱、目、科、屬、種6個種系發育水平下比較C組和H組物種組成差異，沒有發現齲病特異性致病菌，即不存在齲患者群中可檢測到，而健康人群中未檢測到的物種（圖4）。從門到種6個水平下均檢測到在兩組間相對豐度存在顯著差異的細菌種類（圖4，P＜0.05）：（1）門水平，梭桿菌門（Fusobacteria）、TM7；（2）綱水平，梭桿菌綱（Fusobacteriia）、芽孢桿菌綱（Bacil-li）；（3）目水平，梭桿菌目（Fusobacteriales）、巴氏桿菌目（Pasteurellales）；（4）科水平，普氏菌科（Prevotellace-ae）、巴氏桿菌科（Pasteurellaceae）；（5）屬水平，普氏菌屬（Prevotella）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）；（6）種水平，變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、異殊韋榮球菌（Veillonella dispar）、普氏菌 －317（Prevotella 317）、副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）。

圖4 H組和C組齦上菌斑菌群種系發育信息的比較Fig 4 Difference of microbial composition of supragingival plaque between H group and C group

2.5 基于齦上菌斑微生物建立ECC評估模型

首先，篩選對建模最優的種系發育水平，發現利用細菌種水平圖譜可獲得性能最佳模型（AUC＝0.71，圖5）；其次，基于本研究中已篩選出的4個在兩組間顯著差異表達的細菌種構建模型，可得到性能接近于基于全部細菌種信息構建的評估模型（AUC＝0.68，圖5）；最后，分別用這四個細菌種獨立建模，變形鏈球菌亦可得到性能較好評估模型（AUC＝0.68，圖5），提示這些微生物因子在低齡兒童齲病風險評估方面具有潛在應用價值。

圖5 利用齦上菌斑菌群圖譜建立齲病分類模型Fig 5 Caries classifications based on supragingival plaque microbiota profile

3 討 論

本研究中，健康和患齲兒童的性別分布均衡（P＞0.05），不同性別來源的兒童口腔微生物組沒有差異（P＞0.05）。與之前研究結果一致［6］，重度低齡兒童齲兒童和健康者齦上菌斑菌群多樣性和結構均存在顯著差異。而且，患齲兒童之間的群落結構相比健康者間距離較遠且更為復雜，提示齲病菌群可能存在個體異質性［2，7］。此外，在H組和C組中均沒有檢測到“齲特異性”細菌。這些結果說明齲病涉及的微生物變化比所預期的要復雜，不是某種特異性微生物導致的，而是口腔生物膜菌群的結構在整體上發生了改變，這也證實了“生態菌斑假說”［8］。

通過對種系發育水平的研究得出齦上菌斑微生物群落的在門水平的構成與以往兒童口腔齦上菌斑研究一致［9］。本研究篩選出在齲病中高表達的細菌，主要屬于鏈球菌屬、普氏菌屬和韋榮球菌屬，即這些口腔常駐微生物轉變為了致病微生物，這亦證實了微生態失衡是多種微生物作用的結果，從而導致齲病的發生發展［8］。其中，變形鏈球菌是最常見的致齲細菌，具有高度產酸和耐酸特性，其致齲能力強于其他產酸菌［10］。變形鏈球菌在牙菌斑微環境中通過發酵多種化合物產酸，并且生長、發育、代謝，最終導致牙齒脫礦、齲損加重［11］。韋榮球菌主要利用碳水化合物代謝出中間產物（乳酸），將乳酸轉化為酸性較弱的丙酸和乙酸，并在低pH值環境下有利于變異鏈球菌等致齲菌進行代謝產酸過程［12－13］。普氏菌在體外培養時發現沒有產酸性，僅具備中度耐酸能力［14］，但大量齲病研究發現普氏菌在牙本質齲中高表達，可能通過自身的蛋白溶解特性參與齲病的發生發展［2，15－16］。

人類微生物組核心目標之一是利用共生菌群診斷和預測疾病。本研究基于牙菌斑菌群信息建立了齲病風險評估模型，其辨別齲病和健康樣本的準確率均可以達到71%；尤其是使用篩選的4個細菌種類和變形鏈球菌分別建立的齲病評估模型均與全菌譜模型的性能比較相似。本研究結果提示可以利用其建立快捷和精確的齲病風險評估方法，是否可直接應用于臨床預測高危人群，亟待于進一步研究驗證。