黃土高原雨養區苜蓿種植年限對土壤固碳細菌豐度和活性有機碳組分的影響

蔡雪梅，潘占東，羅珠珠,2，李玲玲，牛伊寧，蔡立群,2，劉家鶴

（1. 甘肅農業大學資源與環境學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州 730070）

西部黃土高原雨養區是中國乃至世界水土流失最嚴重的地區之一，嚴重的水土流失不僅破壞生態環境，而且降低土壤質量并減少土壤碳固存[1-2]。紫花苜蓿(Medicago sativa)根系具有較強的根瘤固氮作用，能夠增加土壤有機質和氮含量，改善土壤團粒結構，對于西北生態脆弱區的生態修復和土壤質量提高起著極為重要的作用[3]。但是，作為多年生牧草，苜蓿持續種植一定年限后會導致草地嚴重退化[4]、地面覆蓋度與產量下降，再加上刈割時地上生物量被大量帶走，苜蓿枯枝落葉對土壤的歸還量減少，土壤有機碳含量降低，因此苜蓿種植年限對土壤固碳效應有一定的影響。有研究表明，苜蓿地土壤固碳潛力隨著種植年限的延長而逐漸增加，但增長速度不顯著[5]。也有研究表明，紫花苜蓿土壤有機碳含量在種植5～10 年時為增長期，之后呈現降低趨勢[6]。目前對于苜蓿地土壤碳庫的研究主要集中在分析土壤總有機碳含量的變化上[3,6]，而對土壤活性有機碳組分變化的分析相對較少。土壤活性有機碳(可溶性有機碳、易氧化有機碳和微生物生物量碳)是土壤有機碳庫中最為活躍的組分，其含量較少，但受植物、微生物、土壤環境等影響強烈，降解速率較快，常被認為是評價農田管理措施的早期敏感指標[7]，對于研究土壤質量變化及碳循環具有重要意義。

自養微生物廣泛分布在農田生態系統中，具有同化固定CO2并將其轉化為土壤活性有機碳的潛力[8-9]?？栁难h是自養微生物固定大氣CO2的主要途徑[7,10]，1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)是該循環的限速酶和關鍵酶[11-13]，cbbL基因是RubisCO 酶的編碼基因[14]。RubisCO 酶及其編碼基因cbbL已被許多研究者在環境樣品和光合細菌中進行了大量研究[15-17]。近年來，其在農田生態系統中的研究已成為熱點課題[18]。研究表明，不同的土壤類型[19]、植被類型[9]和施肥方式[20]會影響土壤cbbL基因豐度和多樣性，并且RubisCO 酶活性可以作為衡量土壤自養微生物碳同化潛力的指標[21]。王蕊等[22]研究發現，林地轉型耕地會使土壤cbbL基因豐度降低，并導致土壤cbbL細菌群落結構發生改變。曹煦彬等[13]研究表明，土壤微生物參與了固碳過程，而且RubisCO 酶及cbbL基因與土壤碳組分具有密切的關系。劉瓊等[18]在稻田土壤中發現，不同稻田土壤碳同化微生物群落結構存在顯著差異，有機碳是功能基因cbbL群落組成的顯著影響因素。另外，Stevenson[23]研究發現，農田土壤有機質降解緩慢，其變化也存在一定的滯后性，因而并不利于短期研究。依托設置在隴中黃土高原雨養區的長期定位試驗，羅珠珠等[2]前期已初步開展了不同年限苜蓿地土壤碳組分的相關研究，結果表明，紫花苜蓿對土壤表層有機碳組分的提高只有達到一定種植年限之后才會表現出明顯的累積效果，但未能深入到土壤微生物層面揭示相關固碳機理。因此，本研究基于固碳微生物視角，量化分析土壤固碳細菌豐度和土壤活性有機碳組分變化特征，探討土壤固碳功能基因cbbL豐度與活性有機碳組分及RubisCO 酶活性之間的關系，并耦合土壤理化因子解析影響cbbL基因豐度和土壤活性有機碳組分的關鍵因子，揭示雨養農業區土壤自養微生物碳同化的機制，以期為深入了解苜蓿地土壤碳循環過程、增加土壤固碳潛力提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗區位于黃土高原半干旱丘陵溝壑區的定西市安定區李家堡鎮麻子川村(35°28′ N，104°44′ E)。該區屬中溫帶半干旱區，平均海拔2 000 m，年均日照時數2 476.6 h，年均太陽輻射592.9 kJ·cm-2，年均氣溫6.4 ℃，≥ 0 ℃年積溫2 933.5 ℃·d，≥ 10 ℃年積溫2 239.1 ℃·d；無霜期140 d，年均降水量390.9 mm，年蒸發量1 531 mm，為典型的雨養農業區。土壤為典型的黃綿土，土質疏松，土層分布均勻深厚。

1.2 試驗設計

試驗以2003 年(18 年，T1)、2005 年(16 年，T2)、2012 年(9 年，T3)、2019 年(2 年，T4)建植的紫花苜蓿草地為研究對象，以農田作為對照(CK)，共設5 個處理，每個處理3 次重復，小區面積為3 m × 7 m。苜蓿所選品種均為當地傳統種植品種隴東苜蓿，播量18 kg·hm-2，行距20 cm。農田為當地主栽作物玉米(Zea mays)地，自2013 年開始連續每年播種玉米，參試品種為先玉335，種植密度為5.25 萬株·hm-2，施純氮200 kg·hm-2，純P2O5105 kg·hm-2，所有肥料在播種時一次施入，生育期不進行追肥。苜蓿草地建植時施純氮105 kg·hm-2，純P2O5105 kg·hm-2，后期均未進行施肥、灌水。

1.3 樣品采集與指標測定

于2020 年6 月下旬(苜蓿第1 茬盛花期和玉米拔節期)進行采樣，每個試驗小區采用五點取樣法，首先將0 - 5 cm 的表層土壤去除(去除地表枯枝落葉層)，再取耕層5 - 20 cm 根區土壤，待5 個采樣點全部取完后充分混合，剔除其中可見的石塊、根和動植物殘體。將土樣分為3 份，一份裝入滅菌的離心管中，在田間放入有冰袋的泡沫盒中帶回實驗室置于-80 ℃冰箱中保存，用于DNA 提?。灰环萃翗臃湃? ℃冰箱用于土壤活性有機碳組分和RubisCO酶活性測定；剩余一份土樣待風干后分別過2、1 和0.149 mm 篩用于土壤理化性質的測定。

土壤pH 采用土水比1 ∶ 2.5 電位法測定[24]；土壤含水率用烘干法測定[24]；土壤總有機碳采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱法測定[24]；土壤可溶性碳采用0.5 mol·L-1K2SO4浸提(土水比1 ∶ 4)土樣，浸提液經0.45 μm 濾膜過濾后，濾液上碳氮聯合分析儀(Jena multi N/C 2100s, Germany)進行測定[25]；土壤易氧化有機碳采用333 mmol·L-1高錳酸鉀氧化法測定[26]；土壤微生物量碳采用氯仿熏蒸，0.5 mol·L-1K2SO4浸提(土水比1 ∶ 4)，碳氮聯合分析儀測定[27]；全氮采用H2SO4消煮-凱氏定氮法測定[24]；全磷采用H2SO4-HClO4酸消煮，鉬銻抗比色法測定[24]；速效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法測定[24]；硝態氮采用2 mol·L-1KCl 溶液浸提(土水比1 ∶ 10)，半自動化學間斷分析儀(Smart Chem AST-6500S)測定[28]。

土壤中RubsiCO 酶活性測定采用超聲波破碎法提取土壤中的蛋白質，用紫外分光光度計在340 nm波長下進行測定[13]。

土壤固碳基因cbbL定量分析：土壤總DNA 采用FAST DNA(116560-200, MP Biomedicals)提取試劑盒提取，所提取的DNA 純度用1.0%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，再用凝膠成像儀(JY04S-3C，北京君意東方電泳設備有限公司)測定。通過實時熒光定量PCR 儀(博日，LineGene9600plus)對cbbL基因數量進行定量分析，所采用引物為K2F( ACCAYCAAG CCSAAGCTSGG)，V2R(GCCTTCSAGCTTGCCSACC RC)。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸40 s，35 個循環。反應體系(20 μL)：10 μL，上游和下游引物(5 μmol·L-1)各0.4 μL，DNA 模板2 μL，無菌水補充至20 μL。

1.4 數據處理

采用Excel 2010 和Sigmaplot 12.5 軟件分別進行數據處理和作圖，采用SPSS 19.0 軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗不同處理下土壤基本理化性質、RubisCO 酶活性、固碳基因cbbL豐度及土壤活性有機碳組分的顯著性，用鄧肯法(Duncan)法在P＜ 0.05 水平進行不同處理間上述數據的差異顯著性比較；采用皮爾遜(Pearson)法和逐步回歸分析法分析cbbL基因豐度與環境因子(土壤基本理化性質、土壤活性有機碳組分和RubisCO 酶活性)之間的關系；用Canoco 5.0 軟件冗余分析(redundancy analysis, RDA)模塊分析土壤總有機碳和活性有機碳組分與環境因子(土壤基本理化性質和RubisCO 酶活性)之間的關系。

2 結果與分析

2.1 種植年限對苜蓿地土壤基本理化性質的影響

不同處理土壤基本理化性質(表1)顯示，土壤水分的變化范圍為14.24%～20.49%，各年限苜蓿處理的土壤水分均顯著低于農田(P＜ 0.05)，但不同種植年限對苜蓿地土壤水分無顯著影響(P＞ 0.05)。土壤全氮在0.96～1.28 g·kg-1，除了2 年苜蓿地外其余種植年限苜蓿地土壤全氮均顯著高于農田(P＜0.05)；研究同時發現，土壤全氮呈現出隨苜蓿種植年限延長而增加的趨勢，表現為18 年顯著高于其他年限(P＜ 0.05)，較2、9 和16 年分別顯著增加了33.33%、13.27%和11.30%。土壤全磷和速效磷均表現為苜蓿地土壤顯著低于農田(P＜ 0.05)，2、9、16和18 年苜蓿地土壤全磷較農田分別降低了9.76%、7.32%、13.41%和12.20%，土壤速效磷較農田分別降低了40.40%、47.05%、48.47%和47.80%；就不同年限苜蓿處理之間而言，全磷含量以9 年苜蓿地最高，16 年苜蓿地最低；速效磷含量表現為2 年苜蓿地顯著高于其余年限(P＜ 0.05)。土壤硝態氮變化范圍為11.42～17.41 mg·kg-1，表現為各年限苜蓿地土壤均顯著低于農田(P＜ 0.05)，2、9、16 和18 年苜蓿地土壤較農田分別降低了33.66%、34.41%、24.64%和19.93%，且其含量隨著苜蓿種植年限的延長而增加。土壤pH 表現為各處理間差異不顯著(P＞ 0.05)。

表1 不同處理土壤基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of soil in different treatments

2.2 種植年限對土壤RubisCO 酶活性及固碳基因cbbL 豐度的影響

不同處理土壤RubisCO 酶活性結果(圖1)顯示，2 年苜蓿地土壤RubisCO 酶活性顯著高于其余處理(P＜ 0.05)，而18 年苜蓿地土壤RubisCO 酶活性顯著低于其余處理(P＜ 0.05)，隨著苜蓿種植年限的延長RubisCO 酶活性呈降低趨勢。

以基因拷貝數作為碳同化功能基因cbbL的絕對豐度(圖1)，苜蓿地土壤cbbL基因豐度顯著高于農田土壤(P＜ 0.05)，且隨著種植年限的延長呈增加趨勢。土壤干土cbbL基因豐度在(1.12 × 108)～(1.96 × 108)copies·g-1，種植年限為2、9、16 和18 年的苜蓿地土壤cbbL基因豐度較農田土壤分別增加了19.64%、48.21%、47.32%和75.00%。就不同種植年限苜蓿地而言，表現為2 和18 年苜蓿地土壤cbbL基因豐度間存在差異顯著(P＜ 0.05)，其余年限間均無顯著差異(P＞ 0.05)。

圖1 不同處理土壤RubisCO 酶活性與cbbL 基因豐度Figure 1 RubisCO enzyme activity and the abundance of cbbL gene in soil with different treatments

2.3 種植年限對苜蓿地土壤總有機碳和活性有機碳組分的影響

各處理土壤總有機碳變化范圍為9.79～11.65 g·kg-1，其中18 和16 年苜蓿地土壤總有機碳顯著高于其余處理(P＜ 0.05)，較9、2 年苜蓿地、農田分別增加了11.16%和7.82%、19.00%和15.42%、18.15%和14.60% (圖2)。土壤易氧化有機碳含量以18 年的苜蓿地最高(3.22 g·kg-1)，農田最低(1.40 g·kg-1)，且18 年苜蓿地與其他處理之間差異顯著 (P＜ 0.05)，較16、9、2 年苜蓿地和農田分別增加了30.36%、76.92%、98.77%和130.00%，16 年苜蓿地較9、2 年苜蓿地和農田分別顯著增加了35.71%、52.47%和76.43% (P＜ 0.05)。不同處理土壤可溶性有機碳含量介于109.59～134.65 mg·kg-1，18 年苜蓿地與其他處理之間差異顯著 (P＜ 0.05)，且較16、9、2 年苜蓿地和農田分別增加了10.52%、12.63%、13.19%和22.87%。土壤微生物量碳變化范圍為107.29～250.51 mg·kg-1，各年限苜蓿地土壤微生物量碳均顯著高于農田 (P＜0.05)，不同年限苜蓿處理之間表現為2 年苜蓿地土壤微生物量碳顯著低于其余年限 (P＜ 0.05)，較9、16 和18 年苜蓿地分別降低了27.17%、32.26%和30.34%。

圖2 不同處理土壤總有機碳和活性有機碳組分Figure 2 Soil total organic carbon and labile organic carbon fractions in different treatments

2.4 土壤cbbL 基因豐度及活性有機碳組分與環境因子間的關系

2.4.1cbbL基因豐度與土壤理化性質相關分析

對cbbL基因拷貝數與環境因子進行Pearson 相關分析(表2)發現，土壤cbbL基因豐度與pH 呈顯著正相關關系(P= 0.012)，與土壤總有機碳(P=0.009)、易氧化有機碳(P= 0.001)、可溶性有機碳(P=0.002)、土壤微生物量碳(P= 0.006)和全氮(P= 0.001)呈極顯著正相關關系，與土壤水分(P= 0.012)、全磷(P= 0.010)和RubisCO 酶活性(P= 0.024)呈顯著負相關關系，與土壤速效磷呈極顯著負相關關系(P=0.004)。然而，分析表明，土壤C、N、P 之間存在較強的共線性(表1、表2、圖2)，于是以cbbL基因拷貝數為因變量，以環境因子為自變量進行逐步回歸分析，所得逐步回歸方程為cbbL= 0.639TN + 0.345pH(R2= 0.675，F= 12.468，P＜ 0.01)，由此表明，土壤全氮和pH 是固碳功能基因cbbL豐度變化的主要影響因子，二者可以共同解釋cbbL基因豐度變化的67.50%。

表2 cbbL 基因豐度與環境因子的相關分析Table 2 Correlation analysis between the abundance of cbbL gene and environmental factors

2.4.2 土壤總有機碳和活性有機碳組分與環境因子之間的關系

土壤總有機碳和活性有機碳組分與環境因子RDA 分析(圖3)結果顯示，環境因子對土壤總有機碳和活性有機碳組分的解釋率為89.1%，第一排序軸解釋率為80.51%，第二排序軸解釋率為7.58%。土壤總有機碳及活性有機碳組分與土壤全氮和pH呈正相關關系，與土壤水分、全磷、速效磷、硝態氮和RubisCO 酶活性均呈負相關關系。土壤水分是影響土壤總有機碳和活性有機碳組分變化的最重要因子，其對方差的解釋率為67.3%；全氮對土壤總有機碳和活性有碳組分變化的影響次之，其對方差的解釋率為11.8%。

圖3 土壤總有機碳和活性有機碳組分與環境因子冗余分析Figure 3 Redundancy analysis (RDA) of soil total organic carbon, labile organic carbon fractions,and environmental factors

3 討論

3.1 不同種植年限苜蓿地土壤固碳基因cbbL 變化特征

不同生態系統下土壤環境因子的巨大差異會導致土壤固碳細菌豐度差異[29]。本研究中不同種植年限苜蓿地和農田土壤均發育于同一母質，土壤基礎理化性質一致，但由于農田和苜蓿地的施肥制度、根系分泌物以及各年限苜蓿的固氮效應不同進而造成土壤理化性質存在一定差異，農田在播種時一次性施入氮肥和磷肥，而苜蓿地只在草地建植初期施肥而后期均不施肥，這使得苜蓿地土壤磷素含量低于農田，但由于苜蓿的固氮作用使其土壤氮含量高于農田，再加上紫花苜蓿是高耗水量作物，連續種植多年后使其土壤水分含量顯著低于農田，因而會影響到土壤固碳細菌豐度。本研究中，土壤cbbL基因豐度表現為在苜蓿地均顯著高于農田，表明苜蓿地土壤具有較強的固碳潛力，對土壤碳匯貢獻較大，這歸因于多年生苜蓿極其發達的地下根系、豐富的根系分泌物以及易降解凋落物等為土壤補充了大量碳源和養分。有研究認為，土壤有機碳含量是影響固碳細菌豐度的重要因素[18,30]。本研究表明，土壤cbbL基因拷貝數與土壤總有機碳、易氧化有機碳、可溶性有機碳和微生物量碳均呈極顯著正相關關系，因為土壤有機碳的降解能為微生物提供各類無機元素等營養物質和能量，同時其降解過程中釋放的大量CO2可以為固碳微生物提供碳源，較高的土壤養分更有利于微生物的生長和繁殖。但劉彩霞等[11]通過研究毛竹(Phyllostachy pubescens)林集約經營對土壤固碳細菌豐度的影響發現，土壤固碳功能基因cbbL豐度與土壤有機碳無顯著相關性。這可能由于植被種類、氣候條件和土壤類型等不同影響固碳微生物活性，進而影響了土壤有機碳的轉化與分配。本研究中土壤cbbL基因豐度雖然隨著苜蓿種植年限的延長而增加，但9、16 和18 年苜蓿地之間并無顯著差異，結合16 和18 年苜蓿地土壤總有機碳和微生物生物量碳均無明顯差異這一現象，可以推測紫花苜蓿種植超過一定年限后土壤固碳量不再增加。土壤理化性質對土壤固碳基因豐度的影響比較復雜[11]，有時候幾種因子的作用可能會相互抵消從而掩蓋某一種或幾種土壤因子與固碳基因豐度的關系。因此，不同研究者由于選擇的區域不同，難以獲得驅動土壤固碳細菌變化因子的一致性規律。本研究相關性分析結果顯示，cbbL基因豐度與土壤C、N 和pH 呈正相關關系，與土壤水分和磷素呈負相關關系；進一步逐步回歸分析發現，土壤全氮和pH 是影響固碳細菌cbbL豐度的主要因子，這與王蕊等[22]通過研究林地轉型耕地對cbbL細菌群落豐度的影響所得結果基本一致。

土壤RubisCO 酶是自養微生物通過卡爾文循環進行CO2同化的關鍵酶和限速酶，可以用來指示自養微生物固碳潛力的強弱[13]。本研究結果表明，RubisCO 酶活性隨著苜蓿種植年限的延長而降低，其中2 年苜蓿地土壤RubisCO 酶活性顯著高于農田；相關分析發現RubisCO 酶活性與cbbL基因豐度呈負相關關系，這與Zhou 等[31]的研究結果一致。但Lynn 等[19]研究認為，土壤RubisCO 酶活性與cbbL基因豐度呈正相關關系。這是因為本研究中cbbL基因豐度是在DNA 水平上測定的，通常在DNA 水平上檢測到基因的存在并不意味著該基因得到了表達，而在RNA 水平上檢測到基因的存在能在很大程度上表明微生物基因處于活性狀態[21]。所以，在今后的研究中需要從RNA 水平上對cbbL基因豐度進行研究，還有待進一步驗證土壤cbbL豐度與RubisCO 酶活性間的關系。

3.2 不同種植年限苜蓿地土壤活性有機碳組分變化特征

土壤活性有機碳是土壤有機碳庫最為活躍的組分，其不僅具有穩定性差、移動性較強的特點，而且易被氧化分解和礦化，能夠強烈地制約植物的生長發育，并對土壤微生物活動產生較大的影響[32-34]。雖然其在總有機碳中所占比例并不高，但是在調節土壤養分循環方面發揮著重要的作用[35-36]。苜蓿種植可以提高土壤碳固存，但土壤固碳效應出現峰值的年限因研究區域不同而異。黃土高原半濕潤區苜蓿地土壤有機碳從種植5 年到種植10 年為增長期，之后開始降低[6]；干旱區沙地過渡帶生長4 年的栽培苜蓿草地碳含量最高，并且土壤還出現了“表聚”現象[37]。馬其東等[38]研究認為，苜蓿地土壤有機質含量均隨種植年限的延長而逐漸增加，但是其增長速率隨著生長年限的增加而降低。本研究結果表明，與農田相比，種植苜蓿可以提高土壤有機碳含量，其中種植16 和18 年苜蓿顯著提高了土壤總有機碳和3 種活性有機碳組分(易氧化有機碳、可溶性有機碳和微生物生物量碳)含量，種植9 年苜蓿提高了3 種活性有機碳組分，而種植2 年苜蓿僅提高了土壤活性有機碳組分中的微生物量碳含量，這表明紫花苜蓿對土壤有機碳的累積作用受到種植年限的影響，只有達到一定的種植年限后才表現出明顯的累積效果，其原因是苜蓿在生長初期為了滿足地上部分生長發育對養分的需求，其地下部分就會消耗大量的土壤養分，而此時期其根系幾乎不固氮，隨著苜蓿種植年限的增加和其生長發育的進行，大量的苜?？葜β淙~物歸還土壤，且其根部會形成大量的根瘤菌，能夠固定空氣中的氮素，同時苜蓿根系也會釋放一些有機分泌物以及部分根系會死亡腐爛，可以使土壤中的有機碳含量增加[2,39-41]。值得注意的是，本研究發現種植16 和18 年苜蓿土壤總有機碳和微生物生物量碳均無明顯差異，說明紫花苜蓿種植超過16 年之后土壤有機碳會維持在一定水平而不再持續增加。但常書娟和張英俊[42]研究發現，苜蓿種植年限越長越有利于土壤固碳，這種研究結果的差異可能與不同研究區域的氣候類型、土壤類型等環境因子有關。另外，由于本研究所涉及的苜蓿地最長年限只有18 年，后續延長紫花苜蓿種植年限的固碳效應還有待進一步研究。RDA 分析結果顯示，土壤水分和全氮是影響土壤總有機碳和活性有機碳組分的主要因子，主要原因是土壤含水量作為土壤的主要理化性質，對土壤通透性以及微生物活性具有一定影響，進而會影響土壤有機碳的分解速率；另外，土壤全氮和有機碳的消長趨勢一致[43]，土壤氮素在一定程度上決定了有機碳的含量，而土壤對碳的固持常常受土壤氮水平的制約。

4 結論

在黃土高原雨養區種植苜蓿較農田顯著提高了土壤固碳細菌cbbL基因豐度，且cbbL豐度隨苜蓿種植年限的延長而增加，RubisCO 酶活性隨苜蓿種植年限的延長而降低。與農田相比，種植16 和18 年苜蓿顯著提高了土壤總有機碳和3 種活性有機碳組分，種植9 年苜蓿提高了3 種活性有機碳組分，而種植2 年苜蓿僅顯著提高了微生物量碳含量，表明紫花苜蓿對土壤有機碳組分的累積作用受到種植年限的影響。逐步回歸分析表明，土壤全氮和pH 是cbbL基因豐度的主要影響因素，而土壤活性有機碳組分主要受土壤全氮和水分影響，這對進一步揭示隴中黃土高原雨養區土壤固碳的微生物機制具有重要的參考意義。