吡非尼酮對糖尿病腎病小鼠腎纖維化的改善作用及機制研究

周芳

(遼寧中醫藥大學附屬醫院藥學管理部，遼寧 沈陽 110032)

糖尿病腎病是糖尿病的重要并發癥之一，其病理特征主要為腎小球硬化、腎小管間質纖維化等，腎纖維化是指腎內細胞纖維化、硬化，進而造成腎實質硬化，形成瘢痕的過程[1]。目前臨床上僅以控制血糖、血壓，應用糖皮質激素、免疫抑制劑等來減緩糖尿病腎病的發展，尚無明確、有效的治療腎纖維化的藥物或手段，因此，尋找有效的治療腎纖維化的方法非常重要。吡非尼酮是一種細胞因子抑制劑，具有防止瘢痕形成的作用，其常用于治療神經纖維瘤、子宮平滑肌瘤等疾病，且療效顯著[2]。但關于吡非尼酮應用于糖尿病腎病的研究尚少。本實驗旨在探討吡非尼酮對糖尿病腎病小鼠腎纖維化的改善作用及相關機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級，ICR雄性小鼠，6～8周齡，體質量20～22 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(浙)2019-0001。

1.2實驗藥品試劑及儀器 吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業有限公司，國藥準字H20133376，規格：100 mg)；1%羧甲基纖維素鈉溶液(美國Sigma公司)；鏈尿佐菌素(美國Sigma公司)；尿蛋白定量測試盒(上海雅吉生物科技有限公司)；Masson染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體、轉化生長因子-β(TGF-β)抗體(英國Abcam公司)，Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)抗體(美國Gene Tex公司)等。Couvter型高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；HM525冷凍切片機(德國MICROM公司)；STM6-LM型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；BDNM-9602G自動酶標儀(美國Biotek公司)等。

1.3方法 將30只小鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組，各10只。三組均正常進食、進水。模型組與實驗組小鼠給予鏈尿佐菌素腹腔注射，以80 mg/kg一次性干預，建立糖尿病腎病模型。造模成功后，將250 mg吡非尼酮溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液，給予實驗組小鼠灌胃，1次/d；正常組與模型組小鼠給予1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃給藥，1次/d；均連續灌胃7 d。

1.4觀察指標 比較三組小鼠腎功能水平，分別收集三組小鼠處死前24 h尿液，使用尿蛋白定量測試盒檢測所有小鼠24 h尿蛋白含量；分別采集三組小鼠眼球血100 μL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平。比較三組小鼠腎組織Masson染色情況，采血后，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖收集腎組織，取腎組織于10%中性甲醛固定，依次經脫水、包埋、脫蠟等制備病理切片，切成2 μm切片，行常規Masson染色，透明、封片，于光學顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織病理學變化。比較三組小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平，取液氮中保存的腎組織，提取總蛋白并測定蛋白濃度，以50 μg蛋白/泳道上樣，經常規電泳并電轉，以5%牛血清白蛋白進行封閉2 h，一抗(1：500)4℃孵育過夜，二抗(1：5 000)37℃孵育1 h，顯色。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量各蛋白條帶光密度(A)值，目的蛋白的相對表達水平為該蛋白條帶與內參GAPDH的比值。

2 結 果

2.1腎功能水平 與對照組比，模型組小鼠24 h尿蛋白含量、BUN、SCr水平均升高，且實驗組顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 三組小鼠腎功能水平比較

2.2腎臟組織Masson染色情況 對照組小鼠腎小管間質無明顯纖維化，未見增生及炎性細胞浸潤等；模型組小鼠腎小管間質有明顯增生、纖維化，并伴有大量炎性細胞浸潤等；實驗組小鼠腎小管間質有輕微纖維化，且僅有少量炎性細胞浸潤等。見圖1。

注：A.對照組；B.模型組；C.實驗組。圖1 光學顯微鏡下觀察海馬組織Masson染色(×100)

2.3TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平 與對照組相比，模型組小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平均升高，且實驗組低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A.對照組；B.模型組；C.實驗組。圖2 蛋白免疫印跡法檢測小鼠腎組織α-SMA、TGF-β、Col Ⅰ蛋白表達

3 討 論

鏈尿佐菌素是一種氨基葡萄糖—亞硝基脲，其屬于廣譜抗菌素的一種，具有良好的抗腫瘤及抗菌的作用[3]，但其可通過葡萄糖轉運蛋白而進入細胞內，對β細胞的毒性進行誘導釋放，且對陽性神經內分泌腫瘤細胞具有毒性作用，進而升高機體血糖水平，且可對腎臟造成損傷[4]。本實驗以鏈尿佐菌素對小鼠進行灌胃干預，成功建立糖尿病腎病小鼠模型[5]。

腎纖維化的病理特征為纖維結締組織增生、腎實質細胞減少、細胞外基質沉積等，若未采取及時有效的治療，其可進一步發展為腎衰竭，進而對患者的生命健康造成嚴重影響[6-7]。激素類藥物是目前臨床治療機體器官纖維化常用方法，但長期使用激素治療可出現庫欣綜合征、水腫、低血鉀等不良反應，影響其療效[8]。吡非尼酮是一種吡啶酮類化合物，具有廣譜的抗纖維化作用，對上皮—間質的轉化具有誘導作用，促進成纖維細胞的增殖與轉化，且對細胞外基質沉積起促進作用，且可誘導其他纖維化因子表達[9]。本研究結果顯示，實驗組小鼠24 h尿蛋白含量、BUN、SCr水平均低于模型組，且實驗組小鼠腎小管間質纖維化及炎性細胞浸潤程度均優于對照組，提示吡非尼酮可改善糖尿病腎病小鼠的腎功能，并可改善腎纖維化，與權曉娟等[10]研究結果基本相符。TGF-β是一種中樞因子，具有放大炎癥的作用，且其水平升高可刺激成纖維細胞的生長和發育，進而促進腎纖維化的發展；α-SMA可反映腎間質纖維化的進展，其表達水平與腎纖維化程度密切相關；Col Ⅰ在機體受到高糖刺激后，由腎小球系膜細胞大量釋放，其表達可直接反映腎纖維化的程度[11]。吡非尼酮可清除活性氧，減少細胞外基質的合成，進而減輕腎損傷，控制腎纖維化進展。本研究結果顯示，實驗組小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平相較于模型組均降低，提示吡非尼酮可減少糖尿病腎病小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表達水平，從而控制腎纖維化的發展進程，與徐建華等[12]研究結果基本一致。

綜上所述，吡非尼酮可改善糖尿病腎病小鼠腎功能及腎纖維化，同時減少小鼠腎組織TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ蛋白表達水平，從而控制腎纖維化的發展進程，可為臨床治療糖尿病腎病提供新的思路，但本實驗樣本量較少，值得大樣本量進一步研究。