紅景天苷對人肺腺癌PC9細胞的上皮-間質轉化作用*

張鵬，孫婉瑾，李嫚，徐玉婷

(1.湖北省中醫院藥事部，武漢 430074；2.湖北省腫瘤醫院中西醫結合科，武漢 430079)

肺癌仍是目前死亡率最高的惡性腫瘤之一。許多肺癌患者在就診時已發生轉移，多數肺癌患者死亡是由癌細胞轉移引起[1]，最近研究[2-3]表明上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤侵襲轉移過程中起重要作用。EMT是指上皮細胞失去其上皮特征，獲得間質特性的過程，它不僅參與胚胎形態的形成、心臟的發育和慢性退行性纖維化，而且促進腫瘤侵襲轉移[4-5]。

紅景天苷(Salidroside)的化學名為對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，其苷元為對羥基苯乙醇，即酪醇。紅景天苷具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、免疫調節，促進骨骼肌生長、抗氧化、增體質、抗疲勞、抗肌萎縮，保護肝臟、神經、肺、呼吸道、心臟以及降血糖、調血脂、抗肥胖等作用。WANG等[6]證實了紅景天苷對肺癌A549細胞的抑制作用是抑制了胞內氧化應激反應與磷酸化p38的表達。但紅景天苷對肺癌細胞的研究鮮有報道。本研究以非小細胞肺癌PC9細胞為研究對象，以一定濃度的轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)處理后，給予不同濃度紅景天苷處理，觀察其對肺腺癌PC9細胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 人肺腺癌PC9細胞為上海肺科醫院肺癌免疫研究室常規傳代培養；小鼠抗人上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、神經型鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌動蛋白-α(α-SMA)、β-連環蛋白(β-catenin，美國Abcam公司，批號分別為Ab76055，Ab18203，Ab8978，Ab7817，Ab32572)。羊抗小鼠IgG(武漢Bioswamp公司，批號：PAB150009)；DMEM(美國Hyclone公司，批號：SH30022.01B)；TGF-β1(美國Peprotech公司，批號：100-21)；纖維連接蛋白(FN)(北京Solarbio公司，批號：F8180)；紅景天苷(北京Solarbio公司，批號：SS8080，純度HPLC≥98%)。紅景天苷用DMSO溶解后，作用于細胞的濃度現配(1，5，10 和20 μg·mL-1)。

1.2儀器 酶標儀(美國Thermo公司，型號：Multiskan FC)，恒溫培養箱(美國Thermo公司，型號：311)，顯微鏡(日本Nikon公司，型號：TS100-F)，流式細胞儀(美國Beckman公司，型號：FC500 MCL)。

1.3細胞培養 肺腺癌PC9細胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下用含10%新生牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1慶大霉素、低糖-DMEM培養基中培養。用0.25%胰酶消化傳代。細胞培養至融合70%～80%后，用無血清培養基饑餓過夜，再加入TGFβ1誘導細胞上皮間質轉化處理48 h，按實驗要求分為6組：對照組，TGF-β1刺激組，刺激+紅景天苷組1 μg·mL-1(sali 1 μg·mL-1組)，刺激+紅景天苷組5 μg·mL-1(sali 5 μg·mL-1組)，刺激+紅景天苷組10 μg·mL-1(sali 10 μg·mL-1組)，刺激+紅景天苷組20 μg·mL-1(sali 20 μg·mL-1組)，肺腺癌PC9細胞在5 ng·mL-1的TGF-β1刺激30 min后，再給予紅景天苷干預，分別在干預后24，48，72 h后進行MTT檢測，在各時間段顯微鏡下觀察細胞形態，并攝像記錄。

1.4MTT繪制生長曲線 取對數生長期的細胞，接種于96孔板，每孔細胞密度約1.0×104個，放入CO2培養箱中培養24 h。每孔內加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL，培養箱內孵育4 h，棄去每孔的液體，并以每孔150 μL的計量加入二甲亞砜，震蕩5～10 min，使甲臜顆粒充分溶解。使用酶標儀檢測490 nm及570 nm的吸光度(A)值，以時間為橫坐標，A值為縱坐標繪制生長曲線。

1.5流式檢測細胞凋亡 取對數生長期的人肺腺癌PC9細胞，制成單細胞懸液，按每孔1.0×104個，將細胞均勻的接種到6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養過夜；用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞，1000 r·min-1，離心5 min，去上清液，PBS重懸潤洗2次；1000 r·min-1，離心5 min，去上清液，PBS重懸細胞100 μL，緩慢加入預冷的80%乙醇700 μL，使乙醇終濃度為70% 4 ℃固定4 h以上，1000 r·min-1，離心5 min，預冷PBS潤洗2次，加入100 μL RNase(50 μg·mL-1)，37 ℃水浴30 min加入PI(50 μg·mL-1)400 μL，4 ℃避光染色30 min流式細胞儀檢測。

1.6Western blotting 分析 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解細胞，每5 min振蕩1次，裂解 20 min，4 ℃下15 000 r·min-1，離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據BCA蛋白定量結果上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳2.5 h，轉膜后NC膜TBS稍蕩洗，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA、β-Catenin一抗過夜，TBST洗10 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重復3次，曝光顯影；采用 BIO-RAD Image Lab 版統計軟件進行灰度值分析。

1.7統計學方法 使用SPSS17.0版統計軟件處理數據，計量組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1細胞生長曲線 與Con組比較，TGF-β1組細胞增殖能力顯著上升(t=207.277，P<0.05)。與TGF-β1組比較，sali 1 μg·mL-1、sali 5 μg·mL-1組、sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的細胞增殖力均顯著降低(F=1665.398，P<0.05)。見圖1。

圖1 細胞生長曲線

2.2細胞凋亡 與Con組[(4.58±0.27)%]比較，與TGF-β1組[(6.21±1.61)%]的凋亡率上升，但差異無統計學意義(t=1.741，P>0.05)。與TGF-β1組比較，sali 1 μg·mL-1組[(7.33±1.11)%]凋亡率差異無統計學意義(t=0.987，P>0.05)；sali 5 μg·mL-1組[(13.71±1.66)%]，sali 10 μg·mL-1組[(26.15±0.83)%]和sali 20 μg·mL-1組[(28.33±1.11)%]的細胞凋亡率均顯著升高(F=180.969，P<0.05)，且在一定范圍內，凋亡率隨著藥物劑量的增加而增加。sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組細胞凋亡率均顯著高于sali 5 μg·mL-1組和sali 1 μg·mL-1組。見圖2。

2.3細胞形態觀察 Con組細胞形態多成橢圓形或者圓形，而經過TGF-β1處理后，大部分細胞形態都明顯拉長，細胞呈梭形，相鄰細胞間連接也變得疏松。sali 1 μg·mL-1組的細胞形態和TGF-β1組形態相似，而sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的細胞形態均多半呈橢圓形，細胞之間連接緊密。見圖3。

2.4相關標記蛋白的表達 與Con組比較，TGF-β1組的N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的表達顯著上升(t=66.452，403.664，161.580，136.670，P<0.05)，而E-cadherin、β-catenin的表達顯著降低(t=261.827，154.260，P<0.05)。與TGF-β1組比較，sali 1 μg·mL-1組、sali 5 μg·mL-1組、sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的表達均顯著降低(F=53 988.214，82 179.748，33 362.584，64 734.791，P<0.05)，而E-cadherin、β-catenin的表達顯著升高(F=54 726.455，63 095.118，P<0.05)。見圖4和表1。

圖2 6組細胞凋亡率

圖3 6組細胞形態

3 討論

腫瘤細胞的侵襲和轉移是惡性腫瘤發展的重要步驟，是導致惡性腫瘤患者死亡率高的重要原因[7]。因此，為了控制惡性腫瘤的轉移，研究腫瘤轉移的機制和特點十分有必要。腫瘤轉移是復雜的過程，首先腫瘤細胞脫離原發病灶，通過血管生成和基底膜重建進入循環系統，經淋巴管、血管，抵達靶器官，形成轉移腫瘤[8-9]。進入循環系統的腫瘤細胞要到達靶器官要克服循環系統的種種障礙，而EMT能令上皮細胞表型和表面抗原均發生改變，增強細胞的遷徙能力，促進腫瘤細胞的轉移[10]。上皮細胞之間連接緊密，游離面和基底面均有顯著極性，且高度有序，形態相對穩定一致[11-12]；EMT的發生使細胞間緊密的連接被打破，失去了原有的有序性，穩定性和極性，呈現出形態各異，排列松散的間質細胞特性。本研究首先探討了紅景天苷對肺腺癌PC9細胞增殖和凋亡影響，發現sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的細胞增殖力下降且凋亡率顯著升高，表明紅景天苷可以抑制肺腺癌PC9細胞的增殖并促進凋亡；進一步，筆者通過細胞形態觀察發現，Con組細胞形態多成橢圓形或者圓形，經過TGF-β1處理后，相鄰細胞間連接也變得疏松。而經過紅景天苷處理的細胞形態多半呈橢圓形，細胞之間連接較緊密，提示紅景天苷減少肺腺癌PC9細胞EMT的發生。

1.Con組；2.TGF-β1組；3.sali 1 μg·mL-1組，4.sali 5 μg·mL-1組，5.sali 10 μg·mL-1組，6.sali 20 μg·mL-1組。

表1 6組相關標記蛋白的相對表達量

在腫瘤惡性程度進展的過程中上皮細胞表面標記蛋白E-cadherin下調，表明腫瘤細胞的粘附能力下降，運動和浸潤能力增強[13-15]，而在神經系統和間質細胞中表達的N-cadherin上調[16]。Vimentin和α-SMA是間質樣細胞的標志性分子，通常在上皮細胞中不表達。具有高侵襲性的非小細胞肺癌(NSCLC)細胞則通常伴有Vimentin和α-SMA的高表達，而將細胞中Vimentin或α-SMA沉默之后，細胞明顯減弱甚至失去侵襲遷移能力[17-18]。在本研究中，sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的Vimentin和α-SMA的表達均顯著降低，而E-cadherin的表達顯著升高，N-cadherin顯著降低，提示TGF-β1組的細胞發生上皮細胞向間質細胞的轉化，經不同濃度紅景天苷處理后，sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的Vimentin，FN，α-SMA表達下調，提示細胞的EMT減弱，紅景天苷能明顯減少肺腺癌PC9細胞EMT的發生，預防腫瘤細胞的遷移和侵襲，與形態學觀察的結果一致。

β-catenin蛋白肽鏈中部arm區域，可以和E-cadherin、上皮生長因子受體(EGFR)等蛋白結合而發揮多種功能[19]。β-catenin對細胞的轉移和EMT有關鍵的調控作用，同時也是Wnt信號通路中的關鍵蛋白[20]，其在細胞質中的濃度直接影響著Wnt信號通路。在正常的上皮細胞中，細胞核內β-catenin含量較少，大量的外源性轉錄因子并不能引發細胞的EMT現象，而在腫瘤細胞中，由于β-catenin的調控系統障礙使β-catenin在核內聚集，外源性的轉錄因子可以誘導細胞發生的EMT改變。另一方面，β-catenin和E-鈣黏素胞內區相連，形成β-catenin/E-cadherin復合體，該復合體在維持上皮極性，穩定性和完整性中發揮重要作用[21]。本研究中sali 20 μg·mL-1組β-catenin表達顯著升高，說明紅景天苷通過上調β-catenin抑制細胞中EMT的發生。

綜上所述，TGF-β1可誘導肺癌細胞上皮細胞向間質細胞轉變，紅景天苷可能通過上調β-catenin抑制肺癌細胞中EMT的發生，減少間質細胞的數量，延緩腫瘤細胞的遷移。