阿司匹林誘導人結腸癌細胞Caco-2凋亡與Lgr5的關系*

陳小燕，吳應強，朱蓉，趙逵

(遵義醫學院附屬醫院1.消化內科；2.全科醫學科，遵義 563099)

近年來，隨著人們生活方式的改變，結腸癌發病率上升位居世界第三的惡性腫瘤[1]。發病年齡日益年輕化，治療也面臨諸多挑戰，早期防治結腸癌具有十分重要的意義。雖然放射治療、化學治療和生物治療等方法在結腸癌治療中顯示出顯著的療效，但并不能徹底治愈結腸癌，這一臨床問題隨著腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs) 概念[2-3]的提出得到了更好地解釋。LENG等[4]研究結果顯示，結腸癌中致瘤細胞高度局限于Lgr5陽性亞群，與Lgr5陰性亞群比較，Lgr5陽性亞群表現出更高的集落形成能力、自我更新能力、分化能力、致瘤性以及干細胞基因和間充質基因的高表達能力。Lgr5目前作為結腸腫瘤干細胞標志物的相關研究已成為熱點。新近研究顯示，Lgr5是Wnt通路的目標基因，Lgr5蛋白在結直腸癌中高表達，與腫瘤的發生、侵潤、轉移以及患者預后均密切相關[5]，進一步表明Lgr5參與了結直腸癌的發生發展，可能作為一個潛在的治療靶點[6]。流行病學和實驗研究顯示，阿司匹林能降低腺瘤和結腸癌發生的風險，有效預防結腸癌發生[7]，但其作用機制未明確。阿司匹林是如何作用于腫瘤干細胞以及對腫瘤干細胞標志物有何影響，目前尚不清楚。筆者前期研究[8-10]結果顯示阿司匹林能夠抑制HT-29(COX-2高表達)和SW-480(COX-2陰性表達)人結腸癌細胞株中如Lgr5等多種腫瘤干細胞標記物的表達。對于阿司匹林如何影響人結腸癌細胞株COX-2低表達的Caco-2中Lgr5表達，筆者進行了深入研究，進一步探討阿司匹林防治結腸癌發生的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 人結腸癌細胞株Caco-2由湖南湘雅大學細胞實驗室提供。阿司匹林購自美國Sigma公司，含量>99.0%，批號：16326。胎牛血清(購自美國Hyclone公司)、DMEM高糖培養基(購自美國Hyclone公司)、胰蛋白及MTT(購自美國Sigma公司)，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技發展有限公司)，辣根酶標記山羊抗兔IgG、兔抗人Lgr5多克隆抗體(購自北京中杉金橋公司)，Lgr5引物、β-actin引物(購自北京江晨宏偉生物科技有限公司)，SYBR Premix Ex Taq 、PrimeScriptTM RT Reagent Kit(購自大連寶生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞的培養 Caco-2細胞置于含10%胎牛血清的杜爾伯克改良基礎培養基(DMEM)中，37.0 ℃、50 mL·L-1二氧化碳(CO2)的培養箱中進行培養，待細胞貼壁融合度約為80%～90%時，用胰蛋白酶-EDTA混合消化液消化傳代后繼續培養。實驗時選取對數生長期的細胞。

1.2.2噻唑藍(MTT)法檢測阿司匹林對結腸癌Caco-2細胞存活率的影響 Caco-2細胞消化離心后重懸于培養基中，調整細胞懸液濃度為1×105個·mL-1，接種于96板，每孔100 μL；空白組用培養基代替，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中過夜；空白組及對照組加入培養基100 μL，實驗組加入不同濃度的阿司匹林，濃度分別為1.0，1.5，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 mmol·L-1，各100 μL，每組設5個復孔；加藥后分別培養24，48和72 h，每孔吸掉上清液100 μL后加入0.5%MTT溶液20 μL，繼續培養4 h；吸去孔內培養液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解震蕩10 min，酶標儀(Thermo Fisher公司，型號MULTISKAN SPECTRUM)測定490 nm波長處的吸光度(A值)。細胞的生長抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%；計算阿司匹林對結腸癌Caco-2細胞增殖的半數抑制濃度IC50，實驗重復3次。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 消化傳代Caco-2細胞，待細胞貼壁過夜后加入各濃度的阿司匹林(5.0，10.0，15.0 mmol·L-1)作用12 h，以及15.0 mmol·L-1阿司匹林分別作用6，12和24 h后消化，離心2000 r·min-1×5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞；PBS洗滌細胞2次(2000 r·min-1×5 min)；加入500 μL的結合緩沖液(Binding Buffer)懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide)，混勻；室溫、避光、反應15 min；流式細胞儀(Beckman Coulter公司，型號：MOFLO)檢測，重復3次。

1.2.4實時-反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Caco-2細胞中Lgr5 mRNA的表達 實驗組加入10 mmol·L-1阿司匹林2 mL，分別作用6，12和24 h，對照組則加入2 mL培養基，消化收集各組細胞懸液，運用Trizol法提取細胞總RNA，全波段酶標儀測定樣品中RNA的純度及濃度，采用反轉錄酶試劑盒逆轉錄c DNA；以cDNA 為模板，分別擴增β-actin 和Lgr5 基因，用于RT-PCR的引物對是由大連寶生物工程公司合成，β-actin上游引物序列(5′-3′)為：TGGCACCCAGCACA ATGAA，下游引物序列(5′-3′)為：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；Lgr5上游引物序列(5′-3′)為：GCTCATGGTAAAACACATTGCCC，下游引物序列(5′-3′)為：TGGGACTACCACCAGAAGGATA；收集擴增產物進行瓊脂糖電泳，參照引物設計要求，每組標本中隨機選取一個，取擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠10 μL，100 V、75 mA電壓電泳30～40 min，以進一步印證擴增產物。最后紫外分析儀(北京通用分析儀器公司，型號Tu-1810)上觀察結果；利用ΔΔCt 2法，即2-ΔΔCT計算出各時間組樣本細胞中Lgr5/β-actin比值；實驗重復3次。

1.2.5免疫組化檢測不同濃度阿司匹林作用后Caco-2細胞中Lgr5蛋白亞細胞定位變化 采用免疫組化EnVision 二步法。制備細胞爬片，待細胞貼壁后分別加入0，5.0，10.0，15.0 mmol·L-1阿司匹林作用24 h后，取出蓋玻片；4%多聚甲醛固定；0.5%TritonX-100處理；先后用3%H2O2及2%牛血清白蛋白100 μL室溫孵育；加一抗(1：600，陰性對照組用PBS代替一抗)4 ℃孵育過夜；加二抗37 ℃孵育1 h；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，雙蒸水洗，晾干，封片，顯微鏡觀察攝像。Lgr5蛋白陽性表達為細胞內出現棕黃色或黃色顆粒。具體操作步驟嚴格按照免疫組織化學染色試劑盒要求進行。

2 結果

2.1阿司匹林對結腸癌細胞株Caco-2存活的影響 MTT結果顯示，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，阿司匹林對Caco-2細胞生長的抑制率逐漸增大，呈時間和濃度依賴性，見圖1，但濃度超過20.0 mmol·L-1時，抑制率不再明顯增大。通過SPSS軟件計算得出干預24，48，72 h阿司匹林的IC50分別為13.649，9.090，6.925 mmol·L-1。

2.2流式細胞術檢測Caco-2細胞凋亡的結果

2.2.1細胞形態觀察 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，空白對照組Caco-2細胞呈梭形，形態均一，貼壁良好，透光性強。5.0，10.0，15.0 mmol·L-1的阿司匹林作用細胞24 h后，細胞貼壁能力明顯減弱，細胞變圓變小，大小不一，數量減少，見圖2。

①與對照組比較，P<0.05；②與24 h組比較，P<0.05；③與48 h組比較，P<0.05。

圖2 不同濃度阿司匹林作用24 h后Caco-2細胞形態學

2.2.2AnnexinⅤ-FITC檢測Caco-2細胞凋亡的結果①流式細胞儀檢測不同濃度阿司匹林對細胞凋亡的影響 不同濃度阿司匹林作用Caco-2細胞12 h后流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡率(AnnexinⅤ+/PI-)和總凋亡率(AnnexinⅤ+)，見圖3。與對照組比較，5.0，10.0，15.0 mmol·L-1的阿司匹林均可明顯提高Caco-2細胞早期凋亡率；除5.0 mmol·L-1組外，其余各組亦可提高Caco-2細胞總凋亡率(n=9，P<0.05)，且阿司匹林促凋亡作用成濃度依賴性，見圖3。

①與對照組比較，P<0.05；②與5.0 mmol·L-1比較，P<0.05；③與10.0 mmol·L-1比較，P<0.05。

②流式細胞術檢測阿司匹林作用不同時間對細胞凋亡的影響 15.0 mmol·L-1的阿司匹林分別作用Caco-2細胞0，6，12，24 h后流式檢測各組早期凋亡率和總凋亡率，見圖4，各時間組早期凋亡率分別為(5.7±1.7)%，(6.5±1.2)%和(13.7±0.65)%，與對照組比較，均可明顯提高Caco-2細胞早期凋亡率；總凋亡率分別為(14.7±1.6)%，(37.0±5.4)%，(70.1±7.2)%，除6 h組，其余各組亦可提高Caco-2細胞總凋亡率(n=9，P<0.05)，且阿司匹林促凋亡作用呈時間依賴性。

①與對照組比較，P<0.05；②與6 h組比較，P<0.05；③與12 h組比較，P<0.05。

2.3阿司匹林對結腸癌細胞株Caco-2中Lgr5 mRNA表達的影響 10 mmol·L-1阿司匹林分別作用于Caco-2細胞6，12，24 h后進行 RT-PCR分析，以β-actin為內參照，檢測各組Lgr5基因表達變化，見表1、表2。擴增產物凝膠電泳成像顯示β-actin、Lgr5長度分別為186 bp、146 bp，均在預定位置，進一步印證了擴增產物，見圖5。對照組Lgr5 mRNA校正灰度值為65.33±2.52，6 h組、12 h組、24 h組分別為29.00±2.00，36.33±3.06，10.33±1.52。與對照組比較，各實驗組Lgr5mRNA的表達均有不同程度下調，其中以12 h組最為明顯，均差異有統計學意義(P<0.05)，結果說明阿司匹林下調了Lgr5 mRNA的轉錄。

2.4Lgr5免疫組化結果 Lgr5蛋白免疫組化陽性產物呈棕黃色或黃色顆粒。結果顯示Lgr5蛋白在人結腸癌Caco-2細胞中大量表達，主要位于細胞質，少數定位于細胞膜，而細胞核不著色，見圖6。5.0 mmol·L-1組中Lgr5蛋白亞細胞定位與對照組相同，也在細胞質和細胞膜表達；10.0 mmol·L-1組和15.0 mmol·L-1組可見Lgr5蛋白亞細胞定位發生了改變，除了細胞膜、細胞質有表達外，細胞核也有明顯表達，見圖6。

表1 10.0 mmol·L-1 阿司匹林對Caco-2 細胞Lgr5 mRNA 表達的影響

表2 阿司匹林作用不同時間下Lgr5基因改變的倍數

3 討論

研究顯示阿司匹林能夠顯著抑制結腸癌細胞株Caco-2的生長，并且誘導細胞凋亡[11-13]。阿司匹林對細胞的抑制作用是否與腫瘤干細胞標志物Lgr5有關呢？本實驗通過研究阿司匹林對人結腸癌細胞株Caco-2中Lgr5表達的影響，旨在從腫瘤干細胞相關標志物角度探討其對結直腸癌防治作用，進一步揭示其所涉及的相關機制。

SAIGUSA等[14-15]研究對體外培養且被照射后的結腸癌細胞和術前放化療的直腸癌患者中Lgr5基因表達水平發現，病理分化程度差及腫瘤復發的患者中Lgr5基因表達量較對照組明顯增高，其生存期更短，上述結果表明Lgr5基因過度表達可能與直腸癌對放化療耐藥性有關，導致直腸癌患者的腫瘤復發，促進腫瘤的轉移，直腸癌、結腸癌的發病情況類似，因此，Lgr5可以作為一個判斷結直腸癌患者預后的理想指標，是一個新的潛在治療靶點。本實驗通過測定阿司匹林作用6，12和24 h后Caco-2細胞中Lgr5mRNA的表達，發現阿司匹林對Lgr5基因表達有明顯的抑制作用，呈良好的時間依賴性，其中以12 h組下調最為明顯，表明阿司匹林主要是集中在12 h內對Lgr5mRNA的表達有顯著抑制作用。由此推測阿司匹林通過抑制結腸癌干細胞Lgr5基因表達而防治結腸癌。那么，阿司匹林抑制Lgr5基因表達涉及的具體機制是什么呢？研究表明阿司匹林等NSAIDs可能通過降低COX的表達[16-17]而抑制Wnt/β-catenin信號通路[18]，并減弱β-catenin/TCF下游靶基因Lgr5的轉錄，以干預腫瘤的發生，這一研究理論印證了本實驗結果。筆者前期的實驗結果提示阿司匹林可能是通過COX-2途徑和非COX-2途徑，且主要通過非COX-2途徑預防結腸癌發生。本實驗中采用的細胞株是COX-2低表達的Caco-2，阿司匹林對Caco-2中Lgr5基因表達抑制呈時間依賴性，這也表明了阿司匹林防治結腸癌的機制可能涉及非COX-2途徑。

M：Marker，1-4泳道為β-actin mRNA(186 bp)在對照組、6 h組、12 h組和24 h組中的表達；5-8泳道為Lgr5mRNA(146 bp)在對照組、6 h組、12 h組和24 h組中的表達。

圖6 Lgr5蛋白在不同濃度阿司匹林作用后Caco-2細胞中的表達部位

多數研究[19-22]已經證實，Lgr5蛋白在結腸癌、腦膠質瘤、卵巢癌等多種人體實體腫瘤中存在高表達情況。Lgr5蛋白在結腸癌中不僅大量表達，而且還存在著表達分布的差異。通過比較正常結腸、癌前病變、結腸腺瘤以及不同分化的腺瘤、不同分期的腺癌等相關研究表明，Lgr5蛋白的空間分布存在著明顯的區別[23-24]。正常結腸組織中，Lgr5在其腔面表達；在癌前病變組織中，Lgr5的表達不再局限于隱窩基底部；而在結腸腺瘤中Lgr5主要在腔面高表達。此外，在分化程度高的腺瘤中，Lgr5主要在隱窩部表達，較少在腔面表達，反之亦然；腫瘤分期晚的腺癌中，Lgr5也主要在腔面表達。這進一步表明，Lgr5的失巢表達預示著腸道干細胞向癌前病變轉變，并與腫瘤分化、分期明顯相關，其在腫瘤的發生及發展中具有十分重要的作用。因在不同病理狀態下，實體組織中的Lgr5蛋白存在著空間分布的差異。那么Lgr5蛋白在結腸癌細胞內的表達部位是否會因為藥物等因素干預后而出現平面分布的差異呢？這是不是阿司匹林防治結腸癌的又一種機制呢？本實驗中，采用免疫組化檢測各濃度阿司匹林作用Caco-2細胞 24 h后Lgr5蛋白在細胞內表達部位變化，結果顯示Lgr5蛋白在人結腸癌Caco-2細胞中大量表達，主要位于細胞質，少數定位于細胞膜，而細胞核不著色。柴寧莉等[25]通過研究不同病理狀態腸息肉中Lgr5蛋白的表達發現，Lgr5免疫組化陽性產物主要定位于細胞質中，這與本實驗結果基本一致。5.0 mmol·L-1組中Lgr5蛋白亞細胞定位與對照組相同，估計是由于作用時間不夠長或者藥物濃度不高，還不足以導致Lgr5蛋白的表達部位發生變化。隨著阿司匹林藥物濃度提高，10.0 mmol·L-1組和15.0 mmol·L-1組可見Lgr5蛋白亞細胞定位發生了改變，除了細胞膜、細胞質有表達外，細胞核也有表達。由此，本實驗結果表明，阿司匹林能夠影響Lgr5蛋白的細胞內表達部位的改變，且與阿司匹林濃度有關。柴寧莉等[25]研究還顯示了Lgr5蛋白在正常黏膜細胞核和細胞膜幾乎不表達，但在Lgr5蛋白強表達的腺瘤和腸癌中，細胞膜也有一定的表達，表明了Lgr5的細胞中表達部位與腸息肉的病理狀態有關，就這一點，該實驗結果再次印證了本實驗結果。譚曉冬等[26]通過利用免疫細胞化學方法確定PC-1.0和PC-1細胞中Tjp-2的細胞內定位變化的研究，結果表明 Tjp-2蛋白的細胞內定位變化參與調控胰腺癌細胞解離，就此推測阿司匹林可能通過影響腫瘤干細胞標志物Lgr5的細胞內定位變化以達到防治結腸癌的作用。

綜上所述，本研究結果表明，阿司匹林能夠降低結腸癌細胞株Caco-2中Lgr5基因表達，同時影響Lgr5蛋白的亞細胞定位，從而抑制了腫瘤干細胞增殖，以實現防治結腸癌的作用，表明Lgr5可作為抗結腸癌靶向治療的潛在新靶點。然而阿司匹林對COX-2不同程度表達的結腸癌細胞株中的Lgr5均有抑制作用，表明了阿司匹林防治結腸癌的進一步機制主要涉及非COX-2途徑。關于腫瘤干細胞標志物Lgr5與非COX-2途徑的具體關聯還尚不明確。此外，阿司匹林通過何種機制影響了Lgr5的細胞內定位變化，這些都需進一步深入研究。