Box-Behnken響應面法優化頭孢丙烯干混懸劑處方*

肖穎，武美娟，郭遠玲

(廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山制藥總廠藥研所/ 廣東省化學藥原料與制劑關鍵技術研究企業重點實驗室，廣州 510515)

頭孢丙烯是美國食品藥品管理局(FDA)批準的第一個可用于治療兒童中耳炎和鼻竇炎的口服頭孢菌素類抗生素，國內外最多的劑型為片劑，顆粒劑和干混懸劑，在對頭孢丙烯原料及各劑型的雜質研究過程中，筆者在頭孢丙烯干混懸劑原研及自制制劑中雜質K附近發現了尚未見文獻報道的特有雜質Z，且其含量在儲存過程中會增加，通過LC-HR-MS/MS方法鑒定了其結構，并推測這一特有雜質Z的產生與該劑型中的助懸劑及酸度調節劑有關。

響應面法是目前科學研究中經常用到的一種工藝優化、實驗條件優化方法[1-8]，它相對于正交試驗法，可以連續地對實驗的各個水平進行分析，所得結果更加合理、可靠。

本研究通過Box-Behnken 響應面法對頭孢丙烯干混懸劑的處方進行優化，對輔料枸櫞酸、枸櫞酸鈉和微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉的用量進行優化，控制處方中的特有雜質Z，從而保證產品質量及療效。

1 儀器與試藥

1.1儀器 FA-2004 型分析天平(感量：0.1 mg，上海天平儀器廠)；DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(PDA檢測器)；十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(P250 mm×4.60 mm，5 μm)；超聲波處理器；GF-300型電子天平(感量：1 mg，廣州市艾安得儀器有限公司)；ACS-6型電子計量天平(廣州市中興電子衡器廠，感量：2 g)；HLSG-20A濕法混合顆粒機(北京航空制造工程研究所)；XL-250型旋轉式顆粒機(常州市佳發制粒干燥設備有限公司)；PLB-3多功能制粒包衣機(重慶廣廈干燥設備工程公司)；HLS-50實驗室料斗混合機(浙江小倫制藥機械有限公司)；SHH-250SD型藥物穩定性試驗箱(重慶市永生實驗儀器廠)。

1.2試藥 頭孢丙烯(齊魯安替制藥有限公司，批號：8345HJ81TH，濕品含量：95.18%)，枸櫞酸(湖南爾康制藥股份有限公司，批號：100820190501)，枸櫞酸鈉(湖南爾康制藥股份有限公司，批號：001220190515)，蔗糖(嘉興市白浪淀粉制品有限公司，批號：20190331)，微晶纖維素-羧甲纖維素鈉(FMC CORPORATION，批號：EN18832697)，甜橙粉末香精(佛山市三水百花香料香精科技有限公司，批號：20181002-A7)，磷酸二氫銨(分析純)、磷酸(分析純)、鹽酸(分析純)、乙腈(色譜純)、頭孢丙烯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130567-200902，標示含量：異構體 Z 85.9%、E 9.2%)，雜質A對照品(EP，批號：1.0)，雜質B對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：130431-201203)。

2 方法與結果

2.1頭孢丙烯干混懸劑的制備工藝 稱取制粒處方量的頭孢丙烯原料，蔗糖、枸櫞酸、枸櫞酸鈉、微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉等輔料，混合3 min，加入潤濕劑，制軟材，將制好的軟材加入旋轉式顆粒機制顆粒，濕顆粒放入多功能制粒包衣機中進行沸騰干燥，干顆粒加入甜橙粉末香精，混勻即得。

2.2最大未知單雜測定 參照《中華人民共和國藥典》2015年版二部頭孢丙烯顆粒標準，采用高效液相色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0512)測定特有雜質Z。

2.2.1色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱：Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-磷酸二氫銨水溶液(取磷酸二氫銨11.5 g，加水溶解，調節pH值至 4.4，用水稀釋至 1 000 mL)(50：50)；流速：1 mL·min-1，柱溫：40 ℃；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2溶液的配制 ①供試品溶液的配制方法：精密稱取頭孢丙烯干混懸劑適量(相當于頭孢丙烯125 mg)，置25 mL量瓶中，加103 g·L-1鹽酸1 mL使其溶解，用流動相磷酸二氫銨水溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過。

②對照溶液的配制方法：精密量取供試品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，用流動相磷酸二氫銨水溶液稀釋至刻度，搖勻。

③頭孢丙烯雜質對照品溶液的配制方法：取頭孢丙烯雜質A、雜質B對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每毫升中含雜質A 10 μg、雜質B 25 μg的溶液，搖勻。

2.2.3測定 精密量取對照溶液10 μL注入液相色譜儀；在系統適用性實驗符合要求的條件下，調節檢測靈敏度，使主成分峰高約為滿量程；再精密量取對照溶液、供試品溶液與頭孢丙烯雜質對照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1—圖3)，保留時間約22 min為雜質Z。

圖1 頭孢丙烯干混懸劑有關物質色譜圖

圖2 對照溶液有關物質色譜圖

圖3 雜質A、B對照品色譜圖

2.3Box-Behnke響應面積法優選頭孢丙烯干混懸劑處方 以處方中枸櫞酸、枸櫞酸鈉、微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉為因素，未知雜質Z(成品于溫度60 ℃ 75%RH條件下放置5 d后測定)為考察指標，采用Box-BehnkeDesign方法優選其用量。

2.3.1試驗設計 Box-Behnke試驗設計因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 Box-Behnken 響應面試驗設計因素及水平

表2 Box-Behnken 響應面試驗設計和結果

2.3.2Box-Behnken響應面試驗模型的建立以及顯著性檢驗 采用ANOVA分析Box-Behnken 響應面的回歸參數。運用Design-Expert 8.0版軟件對試驗數 據進行二次方程回歸分析，得擬合方程為：Y=1.34-2.31A-0.82B+0.32C+0.14AB-0.22AC-0.010BC+1.73A2+1.53B2+1.60C2(R2=0.989 2)A代表枸櫞酸的用量；B代表枸櫞酸鈉的用量；C代表微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉的用量；R2代表回歸曲線方程的相關系數，式中Y代表雜質Z的含量；由表3可知效應面模型達到極顯著水平，且模型中因素A和因素B對雜質Z的含量均有極顯著影響，因素C也對雜質Z的含量有顯著影響，模型的失擬項不顯著，該模型具有統計學意義。

表3 方差的顯著性檢驗及方差分析

2.3.33D響應面圖及等高線圖 應用 Design-Expert 8.0版軟件，根據擬合方程，以雜質Z的千分含量為響應值，對各因素做3D響應面及等高線圖(圖4)。由圖4可知，雜質Z的含量隨處方中枸櫞酸和枸櫞酸鈉用量的增加而降低，隨微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉用量的增加而上升。

圖4 雜質Z的3D 效應面圖和等高線圖

2.3.4處方優化及模型驗證 運用Design-Expert 8.0版軟件進行。處方預測，得到最優處方為：枸櫞酸用量為16.89 mg；枸櫞酸鈉用量為27.67 mg；微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉用量為23.78 mg；響應值的預測值雜質Z的含量為1.09‰。

按照優化所得處方制備3批頭孢丙烯干混懸劑，并于溫度60度75%RH條件下放置5 d后測定其雜質Z的含量，相應變量的預測值和實測值見表4，結果表明，3批頭孢丙烯干混懸劑雜質Z含量的實測值與預測值基本一致，表明該模型預測性良好，可信度高。

表4 處方預測值與實測值

3 討論

筆者在研究中尚未發現在片劑和顆粒劑中存在這一雜質，但在頭孢丙烯干混懸劑的開發研究中，在原研制劑及自制制劑中均發現了未知雜質Z，其位置在雜質K附近，且在高溫高濕的條件下，雜質Z含量呈增長狀態。通過LC-HR-MS/MS，鑒定了其結構，并推斷其生成過程與干混懸劑中的助懸劑及酸度調節劑有關，本處方中枸櫞酸和枸櫞酸鈉在處方中為酸度調節劑，微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉為助懸劑，本研究通過Box-Behnken響應面法優化處方中有可能影響到雜質Z的輔料枸櫞酸、枸櫞酸鈉和微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉的用量，以保證雜質Z符合質量要求，從而保證產品質量及療效。在處方中加入枸櫞酸16.89 mg及枸櫞酸鈉27.67 mg作為pH緩沖劑，微晶纖維素-羧甲基纖維素鈉23.78 mg作為混懸劑，可達到抑制雜質Z含量增長的目的，保證樣品的穩定性，從而保證產品的質量及療效。