三七不同來源指紋圖譜數字化研究

童湘偉，石坤連，梁業婷，沈 穎，周 蓓，易延逵

（1.漣源市人民醫院藥劑科，湖南 漣源 417100；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515；3.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530001）

三七為五加科多年生草本植物三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]的干燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，用于各種原因導致的出血，淤血和跌打損傷[1]。三七的主要活性成分是三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）[2]，研究主要以該類成分為參照物建立指紋圖譜。據相關文獻記載[3，4]，已有學者對三七總皂苷的提取、分離純化的方法和技術進行了研究。這些成果為其指紋圖譜和藥理的研究奠定了基礎。中藥指紋圖譜[5]是指將中藥適當處理后，應用特定分析手段獲取能夠表示其特性的圖譜，截止2020 年5 月，大批學者對三七指紋圖譜的建立做了研究，包括對三七HPLC 指紋圖譜進行了較多研究[6-8]、采用HPLC 指紋圖譜來鑒別人參、西洋參及三七[9]、利用高效液相聯用質譜技術建立三七藥材的指紋圖譜[10]以及借助主要成分分析和聚類分析方法比較不同批次、產地的三七藥材質量的差異性，為全面評估三七藥材質量提供參考[11]。本文在前期對指紋圖譜研究基礎上，針對天然產物成分的復雜性，提出了包括“全指紋圖譜系”“區間指紋圖譜”的構建等，同時考慮針對目前指紋圖譜研究存在的問題，提出了進行中藥指紋圖譜峰值的數字化問題研究[12]。本次主要對三七指紋圖譜和考察不同來源三七指紋圖譜的波動范圍進行探索。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備 島津高效液相色譜儀（島津<蘇州>有限公司），SK1200H 型超聲器（上海科導超聲儀器有限公司），DFY-300 搖擺式多功能高速中藥粉碎機（溫州頂歷醫療器械有限公司），MSX（SD EE）型電子天平（Sartorius，Goetiingen，Germanny），BL-600 型電子天平（廈門佰倫斯電子科技有限公司）。

1.2 材料及藥品 對照品：三七皂苷R1（中國藥品生物制品檢定所，批號110745-200415，供含量測定用）、人參皂苷Re（中國藥品生物制品檢定所，批號110754-200320，供含量測定用）、人參皂苷Rg1（中國藥品生物制品檢定所，批號22427-39-0，供含量測定用）。藥材：三七（批號：S9219506，購自廣東省藥材公司中藥飲片廠）、三七（批號：S9218412，購自廣東省藥材公司中藥飲片廠）、三七（批號：190705，購自廣東省采芝林醫藥公司）、三七（批號：180907，購自廣東省采芝林醫藥公司）、三七（批號：180608，購自四川薪菊花中藥飲片股份有限公司），上述三七藥材經南方醫科大學中醫藥學院的劉傳明教授鑒定均為五加科三七的干燥根和根莖。試劑：D-101 型大孔吸附樹脂（批號：HC191026，和誠新材料有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱[9，13,14]：InertSustainTM AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫見表1，流速：1.0 ml/min，檢測波長：203 nm，柱溫：25 ℃，進樣量10 μl，記錄時間為70 min。

表1 梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取三七藥材粉末（過60 目篩）2.0 g，置于錐形瓶中，加入70%乙醇50 ml，浸泡30 min，80 ℃恒溫水浴加熱冷凝回流提取1.5 h，過濾，濾液濃縮至2 ml 左右，與適量大孔樹脂（95%乙醇浸泡至無氣泡）混合、拌勻，揮干。D-101 型大孔樹脂柱色譜分離純化，用95%乙醇大孔樹脂浸泡3～4 h 至無氣泡，在色譜柱底部墊一小團棉花，裝大孔樹脂層10 cm 左右，純凈水洗至無醇味，壓平大孔樹脂柱層面，加入樣品，放一團棉花。洗脫，先用200 ml純凈水洗脫，水洗脫液棄去，再用60 ml 80%乙醇洗脫[3]，洗脫流速為60 滴/min，乙醇洗脫液濃縮至干，用70%甲醇溶解，用5 ml 容量瓶定容，混合均勻，通過0.45 μm 的微孔濾膜，即得。

2.3 參照物的選擇和制備 對照品溶液的制備：分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1等三種對照品，用70%的甲醇配制成每5 ml 均含0.4 mg 的一份混合對照品溶液和三份單一對照品溶液。

2.4 測定法 分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，記錄70 min 的色譜圖，即得。以分離度好的、峰形適宜的三七皂苷R1的圖譜峰即8 號峰為參照物峰，記為S 峰，見圖1。

圖1 參照物色譜圖與三七藥材共有指紋峰指紋圖

2.5 三七指紋圖譜的建立 取10 批次同一來源藥材粉末各1 份，按“2.2”項下的方法制備供試品，“2.1”項下的色譜條件測定指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜圖相似度評價系統軟件（2004A 版）”進行處理，以全譜和峰面積進行匹配，以第六批即S6 色譜圖為參照，完成自動匹配數據，生成對照圖譜R，并以其為參照，完成相似度評價，10 批樣品的相似度均在0.80 以上，見圖2。共有指紋峰的標定：采用相對保留時間標定共有指紋峰，以圖譜中三七皂苷R1為參照物，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，計算10 批次指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間。其中10 個色譜峰為各樣品所共有，故標定它們為共有指紋峰。各共有指紋峰的相對保留時間分別為峰-1（0.1722～0.1769）、峰-2（0.2498～0.2535）、峰-3（0.2995～0.3041）、峰-4（0.4055～0.4109）、峰-5（0.4551～0.4604）、峰-6（0.5103～0.5141）、峰-7（0.8324～0.8346）、峰-S（1.0000）、峰-9（1.4172～1.4193）、峰-10（1.5492～1.5546）。同時以各將各色譜峰峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對峰面積，計算10 批次指紋圖譜中各色譜峰的相對峰面積。共有指紋峰的相對峰面積分別為峰-1（0.1837～0.2777）、峰-2（0.0152～0.1104）、峰-3（0.3015～0.5118）、峰-4（0.1128～0.2807）、峰-5（0.0721～0.1343）、峰-6（0.0428～0.0499）、峰-7（0.0288～0.0638）、峰-S（1.0000）、峰-9（5.6985～5.8728）、峰-10（0.7872～0.8160）。

圖2 相似度計算（全譜）圖

2.6 方法學考查

2.6.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜方法進行測定，連續進樣6 次，計算各次指紋峰的相對峰面積和保留時間，結果RSD＜3%，表明色譜儀器精密度良好，符合指紋圖譜測定要求。

2.6.2 重復性試驗 取同一批三七藥材粉末6 份，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜方法進行測定，進樣，計算各次指紋峰的相對峰面積和保留時間，結果RSD＜2.5%，表明本試驗重復性良好。

2.6.3 穩定性試驗 取同一供試品，按“2.1”項下的色譜方法進行測定，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，計算各時間點的指紋峰的相對峰面積和保留時間，結果RSD＜2.2%，表明供試品溶液在24h 內穩定性良好。

3 不同來源三七藥材指紋圖譜波動范圍的考察

3.1 不同來源三七藥材指紋圖譜制定 取5 批不同來源的藥材粉末各1 份，按“2.1”項下的色譜條件，“2.2”項下的方法制備供試品，制定指紋圖譜。以圖譜中三七皂苷R1 為參照物峰，將各色譜峰保留時間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時間和峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間，相對峰面積，圖譜見圖3。

圖3 5 批不同來源的三七指紋圖譜的比較圖

3.2 不同來源三七藥材指紋圖譜波動范圍 對共有峰的相對保留時間、相對峰面積歸納分析其波動范圍。以各不同來源三七指紋譜各色譜峰保留時間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時間和峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各共有指紋峰的相對保留時間分別為峰-1（0.1736～0.1784）、峰-2（0.2425～0.2548）、峰-3（0.2992～0.3056）、峰-4（0.4058～0.4134）、峰-5（0.4527～0.4597）、峰-6（0.5103～0.5151）、峰-7（0.8324～0.8344）、峰-S（1.0000）、峰-9（1.4167～1.4198）、峰-10（1.5497～1.5546）。各共有指紋峰的相對峰面積分別為峰-1（0.1567～0.2272）、峰-2（0.0922～0.2097）、峰-3（0.2402～0.4975）、峰-4（0.1569～0.1997）、峰-5（0.1082～0.1405）、峰-6（0.0487～0.0795）、峰-7（0.0494～0.0847）、峰-S（1.0000）、峰-9（4.0436～5.8524）、峰-10（0.4935～0.8973）。

4 討論

在《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》的通知中，對于中藥注射劑原料來源上要求動、植物藥材均應固定品種、藥用部位、產地、采收期、產地加工和炮制方法，礦物藥應固定產地和炮制、加工方法[13]。這就要求制定產品藥材的指紋圖譜要求來源加工工藝等要固定，對于不同來源加工工藝藥材而言，要分別制定指紋圖譜。本試驗主要考察不同來源藥材的波動范圍，為其質量控制提供試驗依據。本試驗通過10 批次同一來源三七藥材指紋圖譜研究分析，制定了其指紋圖譜；本試驗通過5 批來源不同的三七考察指紋峰的波動范圍；通過初步考察三七藥材指紋峰波動范圍，可以初步確定三七藥材指紋圖譜指紋峰波動范圍如下：相對保留時間分別為峰-1（0.1730～0.1790）、峰-2（0.2400～0.2550）、峰-3（0.2990～0.3060）、峰-4（0.4050～0.4140）、峰-5（0.4520～0.4600）、峰-6（0.5100～0.5160）、峰-7（0.8320～0.8350）、峰-S（1.0000）、峰-9（1.4160～1.4200）、峰-10（1.5490～1.5550）。各共有指紋峰的相對峰面積分別為峰-1（0.1560～0.2280）、峰-2（0.0920～0.2100）、峰-3（0.2400～0.4980）、峰-4（0.1560～0.2000）、峰-5（0.1080～0.1410）、峰-6（0.0480～0.0800）、峰-7（0.0490～0.0850）、峰-S（1.0000）、峰-9（4.0430～5.8530）、峰-10（0.4930～0.8980）。

本結果共有峰的相對保留時間波動范圍較小，而相對峰面積波動范圍較大。共有峰的相對保留時間波動范圍主要跟儀器方法等有關，因而其波動范圍不會很大；相對峰面積波動范圍跟成分的含量相關，不同來源的藥材含量差異越大，波動范圍就越大。因此，建立三七藥材HPLC 指紋圖譜的數字化波動范圍對如何有效把控三七藥材質量有一定的參考意義。本試驗為藥材的質量控制研究提供了可參考試驗依據。但本試驗試驗樣本數較少，試驗使用的三七均產自云南，因而可進一步增加試驗樣本數，收集試驗使用的三七藥材產地盡量覆蓋到三七主要產地。

以往建立三七指紋圖譜的研究中，很少對三七提取液經過分離純化后再建立指紋圖譜。本試驗參考了三七有效成分分離純化的方法，選用D-101 型大孔樹脂對三七藥材提取液進行分離純化[15]。將純化前后的供試品得到的HPLC 指紋圖譜進行比較，結果表明，純化后建立的指紋圖譜，5 min 前的峰高、峰面積會明顯下降，5 min 后的峰的峰高和峰面積降低不明顯，說明純化有利于減少雜質的含量。

綜上，本次初步探究獲得的三七藥材指紋圖譜波動范圍可對三七藥材的質量控制研究提供試驗依據。