不同基因型小麥苗期耐低氮性評(píng)價(jià)及篩選

李俊杰, 杜蒲芳, 石婷瑞, 侯沛佳, 柴新宇, 趙瑞, 汪妤, 李紅霞

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

氮素是作物生長(zhǎng)過程中必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成具有重要作用。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，化肥使用量逐年增加，我國(guó)化肥施用量占世界總量的1/3，且年均增長(zhǎng)速度達(dá)4%，但氮肥利用效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于世界平均水平[1-2]。為了追求產(chǎn)量而過量施肥，降低氮肥利用效率的同時(shí)也造成了環(huán)境污染[3-5]，因此，挖掘作物氮利用潛力可以減少化肥的使用，降低生產(chǎn)成本。評(píng)價(jià)和篩選小麥耐低氮種質(zhì)資源，通過遺傳改良培育氮高效品種，是保障我國(guó)小麥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)綠色發(fā)展的有效途徑。

選擇合適的氮效率相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行耐低氮性鑒定是作物氮高效育種的前提。在水稻(OryzasativaL.)[6-7]、玉米(ZeamaysL.)[8]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[9-10]、谷子(Setariaitalica)[11-13]和大麥(HordeumvulgareL.)[14]等作物中已經(jīng)進(jìn)行了耐低氮性研究。目前耐低氮性評(píng)價(jià)多基于農(nóng)藝性狀表型，翟榮榮等[15]利用4個(gè)苗期性狀(根干重、根冠比、根尖數(shù)和苗干重)和2個(gè)生育后期性狀(有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量)作為指標(biāo)篩選氮高效粳稻品種。李強(qiáng)等[16]選取葉面積、根冠比、根干重和氮積累量等7個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)51個(gè)玉米雜交種進(jìn)行苗期低氮脅迫篩選。連盈等[17]利用苗根長(zhǎng)、根冠比和氮素生理效率等指標(biāo)，對(duì)45份谷子品種進(jìn)行耐低氮性評(píng)價(jià)。姜琪等[18]對(duì)19份大麥品種的耐低氮性進(jìn)行篩選和鑒定，獲得5份耐低氮大麥品種。作物種類不同，篩選壓力的選擇也不相同，已報(bào)道的氮脅迫濃度為0.10、0.25、0.30、0.50和0.60 mmol·L-1等[19-21]。目前關(guān)于小麥耐低氮品種的篩選相對(duì)較少，大量研究表明，不同小麥品種對(duì)氮素的吸收利用能力不同[22-23]。徐晴等[24]研究認(rèn)為，在低氮條件下小麥產(chǎn)量主要由氮素的吸收效率決定。小麥氮素的高效吸收與根系形態(tài)和生物量密切相關(guān)[25]，因此，通過苗期形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行小麥耐低氮性評(píng)價(jià)對(duì)小麥氮高效利用品種的篩選具有重要的指導(dǎo)意義。本研究前期征集到118份小麥種質(zhì)資源，利用苗期水培的方法，設(shè)置低氮脅迫和正常氮兩個(gè)處理，分析氮素對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)發(fā)育性狀(根干重、莖葉干重和根冠比)以及根系形態(tài)指標(biāo)(最大根長(zhǎng)、初生根數(shù)和二級(jí)初生根數(shù))的影響，篩選不同耐低氮性小麥基因型。旨在為小麥耐低氮育種提供材料基礎(chǔ)，為小麥耐低氮脅迫生理機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

118份小麥種質(zhì)資源來自全國(guó)各小麥生態(tài)區(qū)，其中山東48份、河南35份、河北25份、陜西5份、北京3份、安徽和江蘇各1份,均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室彭慧茹教授提供，編號(hào)和品種名稱見表1。

表1 供試小麥材料Table 1 Wheat materials tested in this experiment

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年4月在西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)溫室進(jìn)行。采用裂區(qū)設(shè)計(jì),主區(qū)為氮水平, 設(shè)置正常氮(N濃度為5 mmol·L-1)和低氮脅迫(N濃度為0.1 mmol·L-1)2個(gè)處理，以NH4NO3形態(tài)供應(yīng)。副區(qū)為118個(gè)不同基因型小麥品種(系)。其余營(yíng)養(yǎng)配方為: KCl 1.8 mmol·L-1、CaCl21.5 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 mmol·L-1、KH2PO40.2 mmol·L-1，微量元素和鐵鹽同Hogland營(yíng)養(yǎng)液。

選取籽粒飽滿、大小均一的小麥種子，用1% NaClO溶液消毒,蒸餾水漂洗3遍，避光培養(yǎng)至露白。先挑選萌發(fā)一致的種子腹溝朝下擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置在人工氣候箱(溫度20 ℃，光照16 h/黑暗8 h，相對(duì)濕度65%)培養(yǎng)至幼苗5 cm左右，然后選取生長(zhǎng)健壯的幼苗移栽到Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)至兩葉完全展開。每個(gè)基因型小麥選取5株進(jìn)行正常供氮和低氮脅迫處理4周，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，期間用電動(dòng)氣泵連續(xù)通氣，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 性狀調(diào)查與指標(biāo)測(cè)定

用去離子水漂洗小麥幼苗根部3遍，使用LA-S根系掃描儀(萬深公司，中國(guó))采集圖片，然后用Imagej軟件處理圖片計(jì)算最大根長(zhǎng)(max root length，MRL)、初生根數(shù)(primary root number，PRN)和二級(jí)初生根數(shù)(secondary primary root number, SPRN)。用吸水紙吸去殘留水分, 將植株分為莖葉和根系兩部分于105 ℃殺青30 min，80 ℃下烘至恒重后用萬分之一天平稱取根干重(root dry weight, RDW)和莖葉干重 (straw dry weight, SDW)。

1.4 指標(biāo)計(jì)算與數(shù)據(jù)分析

根冠比(root/shoot ratio, RSR)=根系干重/莖葉干重

(1)

植株干重(plant dry weight, PDW)=莖葉干重+根干重

(2)

各性狀指標(biāo)的耐低氮系數(shù)PI=Xi/CKi

(3)

(4)

隸屬函數(shù)U(Xi)=(PIi-PImin)/(PImax-PImin)

(5)

(6)

(7)

灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)L0ik=(Δmin+ρΔmax)/(Δ0ik+ρΔmax)

(8)

(9)

式中，Xi、CKi分別為低氮水平、正常氮水平下的性狀測(cè)量值；PImin、PImax為各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)的最小值、最大值；ri為各性狀指標(biāo)與綜合耐低氮系數(shù)的相關(guān)系數(shù)，Wi為指數(shù)權(quán)重，表示第i個(gè)性狀指標(biāo)在所有指標(biāo)中的重要程度;Δ0ik為k時(shí)刻兩個(gè)序列的絕對(duì)差，Δmin和Δmax分別為所有比較序列各個(gè)時(shí)刻絕對(duì)差中的最小值與最大值，Δmin=0，分辨系數(shù)ρ=0.5。

運(yùn)用Excel 2010和SPSS分析軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)、方差分析、主成分分析、聚類分析及相關(guān)性分析，R語言的GGE-Bioplot軟件包作GGE雙標(biāo)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種氮水平下小麥苗期氮效率相關(guān)性狀的基因型差異

由表2可以看出，供試材料在正常和低氮脅迫條件下性狀的變異幅度都比較大，對(duì)照組的變異系數(shù)為17.50%～41.78%，低氮組的變異系數(shù)為17.67%～45.86%，變異系數(shù)越大，說明品種間差異越大。低氮脅迫下最大根長(zhǎng)明顯縮短，下降39.51%，莖葉干重降低25.64%。但根干重增加22.23%，根冠比增加64.35%，初生根數(shù)目增加14.14%。由此推斷，低氮脅迫促進(jìn)根系干物質(zhì)量的積累，同時(shí)抑制地上部的干物質(zhì)積累，造成根冠比升高。處理間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，所有性狀指標(biāo)均達(dá)到極顯著水平。結(jié)果表明，低氮處理效果良好，表型明顯。供試材料的耐低氮相關(guān)性狀指標(biāo)具有豐富、廣泛的遺傳差異性，可以用于篩選小麥耐低氮品種。

表2 兩種氮水平下小麥苗期的氮效率性狀指標(biāo)Table 2 Nitrogen efficiency indexes of wheat under two nitrogen levels at seedling stage

2.2 各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)分析

2.2.1各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)的區(qū)間分布 為減小品種間遺傳及生物學(xué)差異造成的誤差，采用耐低氮系數(shù)PI來表征性狀對(duì)氮脅迫的敏感程度。將各性狀指標(biāo)的耐低氮系數(shù)以0.5為組距，分成6個(gè)區(qū)間，統(tǒng)計(jì)數(shù)值的分布頻數(shù)情況。從表3可以看出，不同指標(biāo)的耐低氮系數(shù)在同一區(qū)間或不同區(qū)間的分布頻率和次數(shù)差別較大。其中，根干重耐低氮系數(shù)PI>1的品種占73.51%，說明大多數(shù)小麥根系的干物質(zhì)量在低氮脅迫后增加，根干重對(duì)低氮脅迫響應(yīng)明顯。莖葉干重耐低氮系數(shù)0≤PI≤1區(qū)間的品種占90.68%，說明低氮脅迫致使大多數(shù)小麥苗期地上部的干物質(zhì)積累受到抑制，干重降低。最大根長(zhǎng)耐低氮系數(shù)0≤PI≤1區(qū)間的品種占91.52%，說明低氮脅迫會(huì)降低根系的初生根長(zhǎng)度。結(jié)果表明，根干重、莖葉干重、根冠比、植株干重、最大根長(zhǎng)、初生根數(shù)和二級(jí)初生根數(shù)等氮效率相關(guān)指標(biāo)受低氮脅迫差異顯著，可以用于鑒定小麥苗期的耐低氮性。

表3 小麥種質(zhì)各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)的區(qū)間分布Table 3 Interval distribution of low nitrogen tolerance coefficient of wheat germplasm

2.2.2各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)的相關(guān)性分析

各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)相關(guān)性分析顯示(表4)，根干重與根冠比的相關(guān)性為0.855，莖葉重與植株干重的相關(guān)性為0.894。莖葉干重與最大根長(zhǎng)和根冠比不相關(guān)。各性狀指標(biāo)的耐低氮系數(shù)與綜合耐低氮系數(shù)均顯著相關(guān)，其中根干重和根冠比與綜合耐低氮系數(shù)相關(guān)性最大，分別為0.934和0.779。由此可見，綜合耐低氮系數(shù)RI是衡量品種耐低氮性的重要指標(biāo)之一。

表4 小麥苗期各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis on low nitrogen tolerance coefficient of each trait of wheat seedlings

2.3 小麥苗期氮效率相關(guān)性狀的主成分分析

對(duì)各性狀指標(biāo)的耐低氮系數(shù)進(jìn)行主成分分析(表5)， 提取3個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為 43.575%、22.904%和17.873%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)84.351%。第一主成分貢獻(xiàn)率最大，主要由根干重、莖葉干重和植株干重決定，此主成分主要反映低氮脅迫下植株整體的適應(yīng)性變化。第2主成分中根冠比的特征向量最大(0.801)，莖葉干重的特征向量最小(-0.590)，說明小麥通過減少莖葉干重來增加根冠比從而適應(yīng)低氮環(huán)境。第3主成分中最大根長(zhǎng)的特征向量最大(0.754)，初生根數(shù)目的特征向量最小(-0.645)，說明小麥通過增加初生根數(shù)目來降低最大根長(zhǎng)，此主成分反映根的適應(yīng)性變化。主成分分析可將多個(gè)相關(guān)變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)反映全部指標(biāo)信息的綜合變量，說明這3個(gè)主成分包含了參試品種苗期性狀的大部分信息。

表5 小麥氮效率相關(guān)性狀的主成分分析Table 5 Principal component analysis of nitrogen efficiency related wheat traits

以根干重、莖葉干重和植株干重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用隸屬函數(shù)法計(jì)算兩種氮處理下小麥種質(zhì)的氮效率值，并作散點(diǎn)圖(圖1)。將不同種質(zhì)分成4類:第Ⅰ類為雙高效型(13個(gè))，占11.02%，包括新麥16、新麥19、新麥20、溫9629、太空6號(hào)、蘭考679、洛麥21和花培1號(hào)等；第Ⅱ類為正常氮高效型(11個(gè))，占9.32%，包括石麥22、石優(yōu)17、刑531、邯生923、洛麥31、黃縣大粒半芒、洛麥29和新麥12等；第Ⅲ類為雙低效型(84個(gè))，占71.19%，包括魯麥22、濟(jì)南16、神麥1號(hào)、濟(jì)南矮6號(hào)、桓群4號(hào)、白高38和魯騰1號(hào)等；第Ⅳ類為低氮高效型(10個(gè))，占17.5%，包括山農(nóng)0917、天民198、漯麥8號(hào)、金豐7183、石麥18、新麥208、華育198、魯麥3號(hào)、汝0319和新麥21等。

2.4 不同小麥品種苗期耐低氮性的綜合評(píng)價(jià)

利用性狀指標(biāo)的耐低氮系數(shù)，采用模糊隸屬函數(shù)法計(jì)算出隸屬函數(shù)值U(X)，得出各性狀指標(biāo)的權(quán)重分別為0.228、0.091、0.176、0.190、0.091、0.07和0.154。最后計(jì)算出每個(gè)小麥品種的耐低氮性綜合評(píng)價(jià)值(D)，D值越大表明其耐低氮能力越強(qiáng)。以耐低氮性綜合評(píng)價(jià)值D為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用歐氏最長(zhǎng)距離法對(duì)118份小麥品種進(jìn)行聚類分析, 將其分為5個(gè)類群(圖2)。第1類為氮敏感型(D≤0.152), 包括石新733、鳧山半截芒、石H083-366、新麥20、魯麥23、石優(yōu)17、桓群4號(hào)、山農(nóng)15、德選1號(hào)、石新633、新麥2111、良星77、衡10S29-2、石麥22、邯生923和魯麥12 ，共16個(gè)品種，占13.79%；第2類為氮較敏感型(0.160≤D≤0.237), 包括刑531、白高38、黃縣大粒半芒、洛麥29、蘭考679、山農(nóng)23、邢麥33、新麥19等63個(gè)品種,占總數(shù)的53.39%；第3類為中間型(0.242≤D≤0.365)，包括冀麥325、項(xiàng)麥969、華育198、新麥21、漯麥8號(hào)、新麥208、林麥4號(hào)、新麥13和平原50等34個(gè)品種,占28.81%;第4類為耐低氮型(0.422≤D≤0.465), 包括齊大195、金豐7183和天民198 3個(gè)品種，占2.54%；第5類為強(qiáng)耐低氮型，包括山農(nóng)0917和魯麥8號(hào)，占1.69%。

2.5 各性狀與耐低氮性綜合評(píng)價(jià)D值的相關(guān)性分析

2.5.1灰色關(guān)聯(lián)度分析 灰色關(guān)聯(lián)度分析(表6)顯示，各性狀指標(biāo)與耐低氮性綜合評(píng)價(jià)D值的關(guān)聯(lián)度較高，最小值為0.908，最大值為0.963。關(guān)聯(lián)程度由大到小依次為根干重>莖葉干重>最大根長(zhǎng)>初生根數(shù)>二級(jí)初生根數(shù)。結(jié)果表明,與小麥品種苗期耐低氮性關(guān)系最密切的指標(biāo)性狀為干物質(zhì)量指標(biāo)(如根干重、莖葉干重)，其次是根的形態(tài)指標(biāo)(如最大根長(zhǎng)、初生根數(shù)和二級(jí)初生根數(shù))。

表6 各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)與綜合評(píng)價(jià)D值 的灰色關(guān)聯(lián)度分析Table 6 Grey relational analysis beween low nitrogen tolerance coefficient and comprehensive evaluation D value

2.5.2GGE雙標(biāo)圖分析 利用GGE雙標(biāo)圖對(duì)小麥品種耐低氮性綜合評(píng)價(jià)D值與各性狀指標(biāo)耐低氮系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，通過品種和耐低氮性狀的相互關(guān)系對(duì)不同小麥品種的耐低氮性進(jìn)行分組，并揭示組內(nèi)耐低氮能力最強(qiáng)的品種。將同一方向上距離原點(diǎn)最遠(yuǎn)的品種連接構(gòu)成多邊形，多邊形各邊的垂線把雙標(biāo)圖分成若干個(gè)扇形區(qū)，不同的小麥品種包括相關(guān)性狀分布在不同的扇區(qū)內(nèi)。每個(gè)扇區(qū)內(nèi)“頂角”的品種為所包含性狀表現(xiàn)最好的品種，位于多邊形內(nèi)部或者靠近原點(diǎn)的品種則為表現(xiàn)較差的品種。結(jié)果如圖3所示，以耐低氮品種山農(nóng)0917為代表的扇區(qū)內(nèi)，包含天民198、魯215953、項(xiàng)麥969和魯麥3號(hào)等耐低氮性強(qiáng)的品種，耐低氮性狀為根干重和最大根長(zhǎng)。在耐低氮品種魯麥8號(hào)為代表的扇區(qū)內(nèi)，有金豐7183、齊大195、華育198和漯麥8號(hào)等耐低氮性強(qiáng)的品種，耐低氮性狀為植株干重和二級(jí)初生根數(shù)目。以敏感型品種魯麥12為代表的扇區(qū)內(nèi)沒有耐低氮性狀。這說明不同基因型小麥氮素吸收利用效率存在差異，且耐低氮機(jī)制也不相同。

3 討論

植物的根系特性與氮素的吸收、代謝最為密切。氮素首先經(jīng)根系吸收，然后才能被同化和轉(zhuǎn)運(yùn)，所以根系形態(tài)和生理特性直接影響著植物對(duì)氮素的吸收[26]。根系的總干重、最大根長(zhǎng)、初生根數(shù)目以及次生根數(shù)目都是反映根系吸收養(yǎng)分能力的重要指標(biāo)[27]。裴雪霞等[28]選取了根干重、植株干重、株高、根冠比等形態(tài)指標(biāo)對(duì)小麥苗期耐低氮性進(jìn)行鑒定，篩選耐低氮品種。本研究選擇根干重、莖葉干重、根冠比、植株干重、最大根長(zhǎng)、初生根數(shù)和二級(jí)初生根數(shù)7項(xiàng)指標(biāo)鑒定耐低氮性，全面反映了植株對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明,在低氮脅迫下，大多數(shù)小麥品種的最大根長(zhǎng)降低，根干重和根冠比增加，低氮脅迫明顯抑制植株苗期地上部莖葉的干物質(zhì)積累和根系的伸長(zhǎng)，增加根系的干物質(zhì)積累，這與前人研究結(jié)果基本一致。通過灰色關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，莖葉干重和根干重與小麥耐低氮性關(guān)系最密切。此外，各性狀的變異系數(shù)均大于15%，低氮處理后品種間的變異系數(shù)增加，說明各指標(biāo)對(duì)低氮脅迫敏感，可用于小麥苗期耐低氮性篩選。大多數(shù)研究表明，苗期根系的生理特性和莖葉的繁茂性對(duì)作物全生育期的氮素吸收至關(guān)重要[29]，而且小麥苗期的氮效率相關(guān)性狀和成熟期的農(nóng)藝性狀間存在顯著的相關(guān)關(guān)系[30]，因此該結(jié)果可以作為小麥氮效率篩選的重要參考。但是小麥的不同生長(zhǎng)階段對(duì)氮敏感程度不同，苗期是氮素營(yíng)養(yǎng)敏感期，但是氮素最大利用效率期在拔節(jié)期之后，所以小麥氮高效材料篩選需要田間試驗(yàn)進(jìn)一步佐證，將氮利用效率與產(chǎn)量聯(lián)系起來才能真正篩選出氮高效利用種質(zhì)資源。

本研究利用苗期水培的方法進(jìn)行品種篩選，選取小麥幼苗的形態(tài)和生理性狀為指標(biāo), 分別采用模糊隸屬函數(shù)法和基于主成分的隸屬函數(shù)分析法，對(duì)小麥耐低氮能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。基于模糊隸屬函數(shù)法計(jì)算的耐低氮性綜合評(píng)級(jí)D值將118份不同基因型小麥劃分為5類。結(jié)果表明，山農(nóng)0917和魯麥8號(hào)為強(qiáng)耐低氮品種, 齊大195、金豐7183和天民198為耐低氮品種，可作為耐貧瘠品種種植在土壤缺氮地區(qū)。石麥22、邯生923和魯麥12號(hào)等16份氮敏感型品種, 適合種植在土壤肥沃的地區(qū)。此外，本研究利用主成分分析確定根干重、莖葉干重和植株干重為指標(biāo)，基于隸屬函數(shù)的氮效率值將不同小麥種質(zhì)分為雙高效型、正常氮高效型、低氮高效型和雙低效型4種類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與耐低氮性綜合評(píng)級(jí)D值篩選結(jié)果高度一致，均篩選出耐低氮較強(qiáng)的品種山農(nóng)0917、天民198、金豐7183。兩種評(píng)價(jià)方法充分證明了篩選結(jié)果的可靠性。另外,雙標(biāo)圖分析顯示山農(nóng)0917、天民198的耐低氮性狀為根干重和最大根長(zhǎng)，金豐7183的耐低氮性狀為植株干重和二級(jí)初生根數(shù)目，結(jié)果說明不同小麥品種的根系耐低氮生理機(jī)制不同。