氯化鈣對鹽脅迫下荊芥種子萌發及幼苗生理特性的影響

張勝珍, 馬艷芝

(唐山師范學院生命科學系， 河北 唐山 063000)

當前，日益嚴重的土壤鹽漬化問題已成為制約全世界農業生產的重要因素之一[1]。在鹽漬化土壤中，高濃度的鹽離子(主要是Na+和Cl-)會使土壤水勢下降，造成植物根系吸水困難，形成生理干旱；同時還會產生離子毒害，影響植物對其他離子的吸收(如K+、Ca2+等)，造成礦質營養虧缺與營養失衡。高濃度的鹽分還會破壞質膜透性，使植物生理代謝發生紊亂，最終造成植物生長發育不良，產量降低、品質變劣，甚至植株死亡[2-3]。我國是土壤鹽漬化非常嚴重的國家之一[4]，對大面積鹽漬化土壤進行恢復改良和開發利用是當前農業科研中非常重要的研究方向。

鈣是植物生長發育必需的營養元素之一，具有極其重要的生理功能[5-6]。近年來，鈣在植物抗逆反應中的作用受到廣泛關注。研究表明，在鹽脅迫下適量添加外源鈣不僅可以緩解因鈣素不足而導致的礦質營養虧缺，還可以增強生物膜結構的穩定性，降低質膜透性，從而控制離子的選擇吸收[7]。此外，由于鈣素是偶聯胞外信號與胞內生理反應的第二信使[8]，因此適量添加外源鈣可以保證鈣信號系統的正常發生和傳遞，從而增強植物對鹽脅迫的響應，減輕鹽脅迫對植物的傷害[9]。

荊芥(SchizonepetatenuifoliaBriq.)為唇形科荊芥屬草本植物，其地上部干燥后可入藥，用于感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡瘍初起等疾病的治療，為我國傳統的常用大宗類中藥材之一[10]。由于野生資源的不斷減少，目前荊芥以人工栽培為主，主要分布于河北、江蘇、浙江、東北三省等地區[11]。前人對荊芥的研究主要集中在栽培技術、化學成分、藥理活性及臨床應用等方面[12-15]。作為荊芥主產區的華北和東北地區存在較嚴重的土壤鹽漬化問題[4]，但關于荊芥鹽脅迫的相關研究較少，利用外源物質緩解荊芥鹽脅迫的研究尚未見報道。種子在鹽脅迫環境中順利萌發成苗是植物在鹽漬化土壤中生長發育的前提。鑒于此，本研究采用氯化鈣對荊芥種子進行浸種處理，研究其對鹽脅迫下荊芥種子萌發及幼苗生理特性的影響，尋找緩解荊芥鹽脅迫的最適氯化鈣浸種濃度，并探索其作用機理，以期為荊芥在鹽漬土地區的栽培生產提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取大小均勻、健康飽滿的荊芥種子作為試驗材料，由北京同仁堂河北中藥材有限公司提供。

1.2 試驗設計

根據預試驗及前期研究結果，選擇對種子發芽抑制率在50%左右的150 mmol·L-1NaCl作為鹽脅迫處理濃度。氯化鈣設置2.5(Ca2.5)、5.0(Ca5)、10.0(Ca10)、20.0(Ca20)、40.0(Ca40) mmol·L-1共5個濃度進行浸種處理。選取飽滿的荊芥種子，用0.1%的高錳酸鉀消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后，用不同濃度氯化鈣溶液浸種24 h。將浸種后的種子放入墊有雙層濾紙的培養皿中，每皿100粒，加入150 mmol·L-1NaCl溶液，每處理重復3次。另設蒸餾水對照(CK0)及鹽脅迫對照(CK150)2個對照處理。蒸餾水對照的種子采用蒸餾水浸種24 h，然后加入蒸餾水培養。鹽脅迫對照的種子采用蒸餾水浸種24 h，然后加入150 mmol·L-1NaCl溶液培養，具體操作方法與氯化鈣處理相同。將培養皿置于25 ℃恒溫培養箱中進行發芽培養，每天觀察記錄荊芥種子的發芽情況，并計算發芽勢(germination energy,GE)、發芽率(germination rate,GR)、發芽指數(germination index,GI)、活力指數(vital index,VI)等。于處理第13 d時測定幼苗的株高、根長、鮮重等生長指標及相關生理指標。

1.3 指標測定

1.3.1種子萌發指標測定 以胚根長度為種子長度1/2時作為發芽標準，統計種子發芽情況，按以下公式計算發芽指標[16]。

發芽勢(GE)=前3 d內正常發芽的種子數/供試種子數×100%

(1)

發芽率(GR)=7 d內正常發芽的種子數/供試種子數×100%

(2)

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)

(3)

式中，Gt為t日的發芽數，Dt為相應的發芽天數。

活力指數(VI)=GI×S

(4)

式中，S為第7天的平均苗重。

1.3.2幼苗生長指標的測定 取荊芥幼苗，用濾紙吸干表面的水分，采用游標卡尺測量幼苗的株高和根長，每處理測定10株，重復3次；采用分析天平測定幼苗的鮮重，每處理20株，重復3次。

1.3.3幼苗生理指標的測定 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[17]；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[17]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法[17]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測定采用氮藍四唑法[17]、過氧化物酶(peroxidase, POD)活性測定采用愈創木酚法[18]、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定采用紫外吸收法[17]。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2013進行數據處理與作圖，采用SPSS 19.0進行方差分析，采用Duncan法進行多重比較。

3 結果與分析

3.1 氯化鈣對鹽脅迫下荊芥種子萌發的影響

不同處理下荊芥種子的萌發情況見表1。與CK0處理相比，CK150處理的種子發芽率和發芽勢分別降低52.94%和55.99%，發芽指數和活力指數分別降低53.62%和72.32%，表明150 mmol·L-1NaCl脅迫對荊芥種子萌發有顯著的抑制作用。用氯化鈣浸種處理后，隨氯化鈣濃度的增加，荊芥種子在鹽脅迫下的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數等各項指標均呈先升高后降低的趨勢。5個氯化鈣處理中，Ca2.5處理的各項發芽指標最低，種子發芽率僅為45.00%，發芽勢僅為39.67%，與CK150對照無顯著差異；其余氯化鈣濃度處理的荊芥種子各項發芽指標均顯著高于CK150對照，其中，Ca20處理荊芥種子的各項發芽指標均為最高，發芽率和發芽勢分別為CK150對照的1.73和1.89倍，發芽指數和活力指數分別為CK150對照的1.87和2.45倍。綜上所述，較高濃度的氯化鈣浸種可以有效緩解NaCl脅迫對種子萌發的抑制作用，且20 mmol·L-1氯化鈣效果最顯著。

表1 氯化鈣浸種后鹽脅迫下荊芥種子的萌發Table 1 Seed germination of Schizonepeta tenuifolia Briq. of seed soaking with CaCl2 under salt stress

3.2 氯化鈣對鹽脅迫下荊芥幼苗生長指標的影響

不同處理下荊芥幼苗的生長見表2。與CK0對照相比，CK150處理荊芥幼苗生長受到明顯的抑制，株高、根長及鮮重分別降低74.26%、38.00%和30.28%。用氯化鈣對荊芥種子浸種處理后，隨著氯化鈣溶液濃度的增加，荊芥幼苗的株高、根長和鮮重均呈先增加后降低的趨勢，其中，CK20處理的株高、根長和鮮重等指標均為最大，且顯著高于CK150對照，分別為CK150對照的1.54、1.41和1.24倍；但仍低于CK0對照，尤其是株高僅為CK0對照的39.60%。

3.3 氯化鈣對鹽脅迫下荊芥幼苗生理生化指標的影響

3.3.1氯化鈣浸種對鹽脅迫下荊芥幼苗丙二醛含量的影響 植物在逆境條件下會發生膜脂過氧化作用。丙二醛是膜脂質過氧化的產物之一，其含量的高低可反映膜質過氧化程度和膜系統受損狀況[19]。從圖1可知，與CK0對照相比，CK150處理荊芥幼苗中丙二醛的含量大幅升高，表明荊芥幼苗在150 mmol·L-1NaCl脅迫下細胞膜受到了嚴重損傷。用氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗中丙二醛含量隨氯化鈣濃度的增大先降低后升高。除Ca2.5處理外，其他處理幼苗中丙二醛含量均顯著低于CK150對照。其中Ca20處理幼苗中丙二醛的含量最低，較CK150對照降低46.40%。以上結果表明，氯化鈣浸種可以降低荊芥幼苗的膜脂過氧化水平，減輕荊芥幼苗在鹽脅迫下的膜損傷程度，且20 mmol·L-1氯化鈣浸種效果最好。

3.3.2氯化鈣浸種對鹽脅迫下荊芥幼苗抗氧化酶活性的影響 不同處理下荊芥幼苗中抗氧化酶活性表明(圖1)，CK150處理荊芥幼苗中SOD、POD和CAT活性較CK0對照分別降低了70.73%、36.66%和49.93%。氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗的SOD活性隨氯化鈣濃度的增加先大幅升高，而后小幅降低；各濃度處理的SOD活性均顯著高于CK150對照。POD和CAT活性的變化趨勢與SOD基本一致，均隨氯化鈣濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，但變幅較小。低濃度(<5 mmol·L-1)的氯化鈣處理幼苗中POD和CAT活性較CK150對照相比雖有所升高，但差異不顯著；中高濃度(≥5 mmol·L-1)的氯化鈣處理幼苗中POD和CAT活性顯著高于CK150對照。其中Ca20處理幼苗中SOD、POD、CAT活性均為最高，分別是CK150對照的3.07、1.29和1.71倍。綜上所述，氯化鈣浸種可促進抗氧化酶活性的提高，從而增強清除活性氧能力，減輕鹽脅迫對荊芥幼苗所造成的傷害，且20 mmol·L-1氯化鈣為提高荊芥幼苗抗氧化能力的最佳濃度。

3.3.3氯化鈣浸種對鹽脅迫下荊芥幼苗中脯氨酸及可溶性蛋白含量的影響 植物在鹽脅迫下會在細胞內合成并積累一些滲透調節物質，以平衡外部介質或液泡內的滲透壓。脯氨酸和可溶性糖都是植物體內重要的有機滲透調節物質[20]。由圖2可以看出，CK150處理荊芥幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量較CK0分別提高了4.73和1.93倍，表明150 mmol·L-1NaCl 處理對荊芥幼苗產生了滲透脅迫，從而使脯氨酸和可溶性蛋白大量積累，以調節滲透壓，緩解滲透脅迫。氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量均隨氯化鈣濃度的增大呈現先降低后升高的趨勢。Ca2.5處理幼苗中脯氨酸和可溶性蛋白含量最高；Ca20處理最低。氯化鈣處理的幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量均顯著高于CK0對照。與CK150相比，僅Ca2.5處理的可溶性蛋白與其無顯著差異，其他處理與CK150間差異均達顯著水平。綜上所述，氯化鈣浸種在一定程度上降低了荊芥幼苗在鹽脅迫下對脯氨酸和可溶性蛋白的合成與積累，推測添加外源鈣使得荊芥幼苗在鹽脅迫下可能存在多種滲透調節方式，從而使脯氨酸與可溶性蛋白的累積量減少。

4 討論

種子萌發是植物生長周期中最初和最關鍵的階段[21]，也是抗逆性最弱的階段，易受到環境脅迫的影響甚至傷害。鹽堿脅迫是最嚴重的生態限制因素之一[22]。本研究表明，150 mmol·L-1的NaCl脅迫下，荊芥種子的各項萌發指標均受到抑制。而采用氯化鈣對荊芥種子進行浸種處理后，種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數等隨氯化鈣濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，且各項發芽指標均顯著高于未浸種對照。此外氯化鈣浸種后荊芥幼苗的株高、根長、鮮重等也顯著高于對照，與前人關于外源鈣促進馬齒莧[23]、小麥[24]、豌豆[25]、黃芩[26]等種子萌發的研究結果相一致。

植物在逆境環境下會產生大量的活性氧自由基，從而發生膜脂過氧化作用，丙二醛作為其產物之一，是判斷細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應強弱的重要指標[27]。本研究中，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，荊芥幼苗的丙二醛含量顯著提高，表明在鹽脅迫下荊芥幼苗發生了嚴重的膜脂過氧化反應。而氯化鈣浸種處理后，荊芥幼苗丙二醛含量與鹽脅迫對照相比顯著降低，與前人研究結果相一致[24-26]，表明外源鈣處理可有效地降低荊芥幼苗中MDA的積累，從而減輕鹽脅迫下膜質過氧化作用對細胞的傷害程度。而外源鈣處理后荊芥幼苗中MDA含量降低的原因可能與外源鈣提高抗氧化酶活性有關。植物體內的SOD、POD和CAT等抗氧化酶是植物體內活性氧清除系統的重要成員，它們協同作用，調節植物體內的活性氧平衡，抵御其對膜的結構和完整性造成破壞。本研究表明，在鹽脅迫下荊芥幼苗體內的SOD、POD和CAT活性均顯著降低，而用氯化鈣浸種處理后，幼苗中SOD、CAT和POD的活性均顯著提高，與李小玲等[26]關于鹽脅迫降低黃芩體內抗氧化酶活性，而外源鈣可提高抗氧化酶活性的研究結果相一致。氯化鈣浸種后，荊芥幼苗中抗氧化酶活性的提高降低了植株體內活性氧水平, 抑制了膜質過氧化作用，減少了MDA的累積，從而減輕了細胞膜損傷程度。

當土壤溶液中鹽分含量增加時，滲透壓也隨之提高，從而造成植物根系吸水困難，甚至出現生理干旱現象。因此植物在鹽脅迫下自身會進行滲透調節，即在細胞內積累滲透調節物質，以提高細胞內溶質濃度，降低胞內水勢。滲透調節一般由無機離子(如K+、Cl-、Ca2+等)和有機物質(如游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等)共同參與[5]。本研究結果表明，在150 mmol·L-1NaCl脅迫下，荊芥幼苗的脯氨酸及可溶性蛋白含量與蒸餾水對照相比顯著提高，這正是荊芥在鹽脅迫下受到傷害后的一種自我調節反應。采用氯化鈣浸種處理后的幼苗在鹽脅迫下脯氨酸和可溶性蛋白含量雖整體上高于蒸餾水對照，但均低于未浸種對照，與前人關于外源鈣提高鹽脅迫下巴西蕉[9]、酸棗[20]、沙拐棗[27]幼苗脯氨酸及可溶性蛋白含量的研究結果存在差異。但侍瑞高等[24]研究發現，外源氯化鈣會使鹽脅迫下小麥幼苗中脯氨酸含量降低、可溶性糖含量提高；王志強等[28]研究發現，外源Ca2+顯著降低了小麥在高鹽脅迫下的脯氨酸含量，但增加了K+的吸收，認為增加的K+可部分替代脯氨酸等有機溶質的滲透調節作用，且與有機溶質相比，利用無機離子作為滲透調節劑的耗能更低；蘇江碩等[7]研究發現外源Ca2+使鹽脅迫下菊花幼苗脯氨酸含量降低，認為脯氨酸可能僅是鹽脅迫下的一種產物，外源Ca2+可能是通過保護膜的穩定性、保持離子平衡等其他途徑來減少菊花在鹽脅迫下所受的傷害。本研究中外源鈣使荊芥幼苗在鹽脅迫下的脯氨酸及可溶性蛋白含量降低，推測可能是由于外源鈣使植株啟動了其他脅迫生理響應機制，從而具備了多種滲透調節方式，如提高抗氧化物酶活性、促進無機離子的吸收或其他滲透調節物質的合成等，從而降低了脯氨酸和可溶性蛋白的累積，但具體機制仍需進一步的研究。