固氮施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501 同化硝酸鹽代謝基因簇分布及調控研究

黃麗玲, 李耘, 王珊珊, 陸超, 楊智敏, 林敏, 燕永亮, 陳明, 張維, 王勁, 周正富, 柯秀彬, 戰崳華, 陸偉

(中國農業科學院生物技術研究所， 北京 100086)

硝酸鹽是植物、真菌及許多細菌生長所需重要無機氮源。在有氧條件下將硝酸鹽轉化成氨的過程被稱作硝酸鹽同化，該過程包含三個特異性步驟：由硝酸鹽轉運系統完成的硝酸鹽吸收，進入胞內的硝酸鹽由同化硝酸鹽還原酶(nitrate reductase，NR)催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，隨后由同化亞硝酸鹽還原酶(nitrite reductase，NiR)催化亞硝酸鹽還原成氨，最終氨經谷氨酰氨合成酶(glutamine synthetase，GS)催化生成谷氨酰胺摻入到中心代謝途徑。在氮循環系統中，硝酸鹽同化對藻類等植物營養和生長的重要性早已通過大量研究得到認可[1-3]，由于異養細菌的主要作用通常被認為是分解和降解顆粒狀有機氮而鮮少受到關注，直到近些年異養細菌硝酸鹽同化研究才引起重視，例如：Rhodobactercapsulatus[4-5],Klebsiellaoxytoca[6-9],Azotobactervinelandii[10-16]和Bacillussubtilis[17-18]。

硝酸鹽和亞硝酸鹽均是帶電分子，不能快速穿越生物膜，特別是硝酸鹽(pKa=-1.3)需要轉運蛋白轉運，而亞硝酸鹽通常被認為可以不經過特定蛋白轉運而通過被動擴散形式進入細胞內[19-20]。硝酸鹽轉運蛋白有兩種類型：一類是細胞周質結合蛋白依賴系統，通常由ATP水解提供能量，屬于ABC轉運蛋白家族，也被稱作ATP驅動硝酸鹽轉運蛋白，例如K.oxytoca中的NasFED和Cyanobacteria中的NrtABCD；另一類是依賴于質子移動勢的NarK家族轉運，屬于主要協同超家族(major facilitator superfamily,MFS)，例如A.vinelandii中的NarK和Paracoccusdenitrificans中的NasA。

硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶是硝酸鹽同化的兩個關鍵酶，均存在于細胞質內。硝酸鹽還原酶都含有鉬輔因子和鐵-硫簇，真核生物中鉬輔因子是鉬-鉬喋呤(Mo-MPT)，而細菌中則是鉬-鳥苷二核苷酸鉬喋呤(Mo-MGD)，其催化中心由鉬輔因子和[4Fe-4S]簇組成[19]。電子供體在不同細菌中存在區別，在Azotobacter中是黃素氧還蛋白，而在Klebsiella 和 Bacillus中則來源于NAD(P)H還原態亞基[21]。亞硝酸鹽還原酶均含有西羅血紅素和鐵-硫簇，在植物和藍藻中電子供體為鐵氧還蛋白，而在細菌和真菌中電子來自于NADH和/或 NADPH[22]。

PseudomonasstutzeriA1501是一株分離自水稻根際的聯合固氮菌[34-36]，為適應水稻田特殊的生存環境，該菌進化出多樣氮轉化系統，包括固氮、反硝化、硝酸鹽同化等。在水稻田淹水厭氧條件下，該菌能夠利用硝酸鹽作為電子受體進行反硝化反應，將硝酸鹽還原為氮氣并獲得能量；而在非淹水有氧條件下，該菌可以通過同化作用利用硝酸鹽為唯一氮源生長；同時，在水稻根際微氧條件下，該菌還可以進行固氮反應，將氮氣轉化成氨，供自身及植物生長。2008年，燕永亮等[37]對該菌進行了基因組測序，序列比對分析發現，該菌包含一個49個基因組成的固氮基因簇[38]，一套完整的硝酸鹽呼吸系統[39]以及硝酸鹽/亞硝酸鹽同化基因簇。在此基礎上，本研究利用生物信息學方法對這套完整的硝酸鹽同化基因簇進行研究和分析，為揭示P.stutzeriA1501硝酸鹽同化的調控機制奠定基礎，同時進一步闡明該菌硝酸鹽/亞硝酸鹽同化作用,對于理解細菌環境適應機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及生長條件

1.2 生物信息學分析

P.stutzeriA1501基因組序列已在GenBank上登記，登錄號為CP000304.1。采用NCBI中Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列比對，利用NCBI網站上保守結構域數據庫(conserved domain Database，CDD)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.)分析蛋白序列保守結構域。

1.3 nasT和nasR基因非極性突變株及功能回補菌株的構建

參考P.stutzeriA1501nasT和nasR序列設計引物(表1)，以基因組DNA為模板擴增nasT和nasR5’上游序列，PCR產物和pK18mob 質粒分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收目的片段，再分別將nasT和nasR5’上游片段連接到pK18mob載體上，連接產物轉化大腸桿菌JM109，構建重組大腸桿菌JM109nasT和JM109nasR。采用三親結合法[41]將重組質粒轉入P.stutzeriA1501中，利用同源交換原理將pK18mob整合插入到P.stutzeriA1501基因組相應位置，經卡那霉素篩選及PCR檢驗，分別獲得nasT和nasR基因非極性突變菌株A15nasT和A15nasR。

表1 nasR、nasT非極性突變株與回補株構建引物Table 1 Primers used in construction of the nasT, nasR mutants and complementary strains

利用分別帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的上下游引物擴增nasT和nasR基因，PCR產物和廣宿主質粒pLAFR3分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收目的片段，將nasT和nasR基因連接到pLAFR3載體上構建重組質粒pLAFR3nasT和pLAFR3nasR，轉化大腸桿菌JM109。采用三親結合法[41]將重組質粒轉化P.stutzeriA1501，經四環素壓力篩選及PCR驗證獲得回補菌株Comp-A15nasT和Comp-A15nasR。

1.4 硝酸鹽攝取能力測定

參考Van等[45]方法測定胞內硝酸鹽含量。12 000 r·min-1離心收集菌體(先測定菌株OD600吸光值，按照三種菌株總OD600數值相同收集適量的菌體)，用預冷的磷酸緩沖液洗菌三次，再用磷酸緩沖液重懸菌體，超聲破碎20 min，破碎液12 000 r·min-1離心收集上清液；0.5 mL的上清提取物中分別加入5 mL 0.55% Ca(CH3COO)2·H2O 溶于4% 氨水溶液，0.1 mL 1% MnSO4·4H2O 溶于5%乙酸溶液和0.1 g鋅粉，劇烈震蕩1 min，濾膜過濾反應液，收集到的濾液放置冰上；2 mL濾液加入0.5 mL 1% sulfanilamide溶于5 mol·L-1HCl溶液，混勻后測量OD540值。

1.5 RT-PCR

2 結果與分析

2.1 P. stutzeri A1501硝酸鹽同化基因簇分布

基因組序列比對分析顯示，P.stutzeriA1501在2 622 929～2 637 956和4 444 490～4 449 171各存在一個硝酸鹽同化相關基因簇(圖1)。

2.1.1基因簇1分析 基因簇1包含13個開放閱讀框(ORF)，從nasS至cobA(圖1)。nasSORF由1 449 bp核苷酸組成，編碼482個氨基酸，其后nasTORF由627 bp核苷酸組成，編碼208個氨基酸，這兩個基因之間有35 bp重疊，處于一個轉錄單元。NasS編碼蛋白同源性比對顯示，該蛋白屬于ABC轉運子底物結合蛋白，是Ⅱ型細胞周質結合蛋白超家族中的一員，該超家族主要包含NrtA和CmpA蛋白，分別是硝酸鹽和碳酸氫鹽的受體結合蛋白，而NasT編碼蛋白含有ANTAR (AmiR and NasR transcription antitermination regulators)結構域，其主要存在于一類轉錄抗終止調節蛋白中[8,12,42]。上述兩個蛋白的結構和功能預測與已報道菌株的硝酸鹽同化兩組分調節蛋白NasS-NasT非常相似[12]，其中NasS序列與A.vinelandiiDJ NasS序列一致性為61.46%，NasT序列與A.vinelandiiDJ NasT序列一致性為78.85%，與P.denitrificansPD1222 NasS和NasT序列一致性分別為26.36%和36.84%[31]。

PST_2402、PST_2405和 PST_2408功能未知，PST_2403是個硫酯酶家族蛋白，PST_2404是1-磷酸果糖激酶家族己糖激酶，PST_2407推測為絲氨酸/蘇氨酸激酶。

nasA由1 212 bp核苷酸組成，編碼403個氨基酸。生物信息學分析顯示該蛋白是NarK/NasA家族硝酸鹽轉運蛋白，屬于主要協同超家族(major facilitator superfamily，MFS)轉運蛋白，功能是跨膜轉運硝酸鹽或亞硝酸鹽。

nirB由2 466 bp核苷酸組成，編碼821個氨基酸，其結構類似于亞硝酸鹽還原酶大亞基，屬于NirB超家族蛋白[NAD(P)/FAD-dependent oxidoreductase，NirB]。nirD由330 bp核苷酸組成，編碼109個氨基酸，該蛋白含有一個Rieske domain和一個 [2Fe-2S] 簇結合位點，屬于NirD超家族蛋白[NAD(P)H-dependent nitrite reductase,NirD]。nasB由2 706 bp核苷酸組成，編碼901個氨基酸，該蛋白含有鉬喋呤二核苷酸結合結構域和[4Fe-4S]結構域，與AzotobactervinelandiiDJ菌種NasB一致性為78.60%，該酶利用單核鉬輔因子催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。cobA由840 bp核苷酸組成，編碼279個氨基酸，該基因與上游基因有76個堿基的重疊，編碼尿卟啉-Ⅲ C-甲基轉移酶，該酶參與西羅血紅素合成，而西羅血紅素是亞硝酸還原酶的輔因子。

2.1.2基因簇2分析 第二個基因簇含有4個ORFs:nasR、nasF、nasE和nasD(圖1)。其中nasR由1 302 bp核苷酸組成，編碼433個氨基酸。該蛋白N端含有硝酸鹽/亞硝酸鹽感受結構域(NIT)，C端含有抗轉錄終止因子結構域(ANTAR)，與K.oxytocaM5a1 NasR結構相似，序列一致性為30.80%，推測其功能也是感受硝酸鹽/亞硝酸鹽，起抗轉錄終止作用，正調節下游硝酸鹽同化操縱子的表達。

nasF至nasD處于同一操縱子，共同編碼ABC轉運家族蛋白。nasF編碼細胞周質硝酸鹽/亞硝酸鹽結合蛋白，推測與NrtA功能類似，與K.oxytocaM5a1 NasF序列一致性為38.03%；nasE編碼硝酸鹽ABC轉運透性酶，與NrtB功能類似，與K.oxytocaM5a1 NasE序列一致性為39.39%；nasD編碼蛋白具有ATP結構域，屬于ATP結合轉運蛋白，與NrtC和NrtD功能類似，與K.oxytocaM5a1 NasD一致性為62.21%。

2.2 nasT、nasR突變對硝酸鹽利用能力的影響

2.2.1硝酸鹽同化能力分析 生物信息學分析結果顯示，P.StutzeriA1501中存在兩個硝酸鹽同化基因簇，nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED，這樣的基因簇分布方式還未見報道。已有研究結果表明，硝酸鹽同化基因通常組成一個基因簇行使功能[14,17,46-48]。

從P.stutzeriA1501硝酸鹽同化基因排布情況推測NasS-NasT和NasR分別調控各自下游基因的表達，為驗證上述推測，分別構建了nasT和nasR基因突變株A15nasT和A15nasR，以及突變株回補菌株Comp-A15nasT和Comp-A15nasR。培養實驗結果(圖2)表明，nasT和nasR突變均不影響菌株在銨鹽培養基中的生長，而在硝酸鹽培養基中nasR突變株生長能力下降了約一半，nasT突變株則完全喪失了生長能力。

2.2.2硝酸鹽轉運能力分析 隨后測定了A15nasT和A15nasR突變株將硝酸鹽轉運至胞內的能力(圖3)。結果表明，nasR突變硝酸鹽轉運能力下降了約60%，而nasT突變對硝酸鹽轉運幾乎沒有影響。結合生長實驗結果初步判定NasR調控硝酸鹽轉運，而NasT調控硝酸鹽/亞硝酸鹽還原。

2.3 硝酸鹽/亞硝酸鹽同化基因表達分析

為進一步明確上述結果，對兩個突變株中主要硝酸鹽/亞硝酸鹽同化基因表達情況做了RT-qPCR分析(圖4)。在A15nasR突變株中調控基因nasST和硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶基因(nirBDnasBcobA)表達沒有顯著變化，但是硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運基因(nasFED)表達顯著下調；在A15nasT突變株中調控基因nasR和硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運基因(nasFED)表達沒有顯著變化，但是硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶基因(nirBDnasBcobA)表達顯著下調。

上述結果表明，在P.stutzeriA1501中，NasS-NasT系統調控該菌同化硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶基因的表達，NasR調控硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運基因的表達，而NasS-NasT和NasR之間沒有調控關系。

3 討論

3.1 P. stutzeri A1501同化硝酸鹽/亞硝酸鹽相關基因命名

歷史上由于對硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝研究階段及對象的不同，研究人員不可避免的對不同生物中同源基因給予了不同命名，至今也沒有統一，給后續研究帶來了一定的困擾。例如ABC同化硝酸鹽轉運包括細胞周質結合蛋白、膜蛋白和ATPase，在Cyanobacteria中上述蛋白編碼基因命名為nrtA、nrtB和nrtCD，在K.oxytoca中則命名為nasF、nasE和nasD；MFS家族硝酸鹽轉運蛋白編碼基因在P.denitrificans和B.subtilis中命名為nasA，在A.vinelandii和Methylococcuscapsulatus中命名為narK。根據基因結構、相似度以及為了區分硝酸鹽呼吸系統中narK基因，本研究暫將P.stutzeriA1501中這兩類轉運蛋白編碼基因分別命名為nasFED和nasA。

同化硝酸鹽還原酶編碼基因在P.denitrificans和B.subtilis中命名為nasC，在A.vinelandii和K.Pneumoniae342中命名為nasB，R.capsulatus和Haloferaxmediterranei中命名為nasA，在PseudomonasentomophilaL48中命名為narB，根據基因相似度將P.stutzeriA1501中同化硝酸鹽還原酶暫命名為nasB。

同化亞硝酸鹽還原酶大亞基編碼基因在A.vinelandii中命名為nasA，在P.denitrificans和K.Pneumoniae342中命名為nasB，在B.subtilis和H.mediterranei中命名為nasD，在R.capsulatus和P.entomophilaL48中命名為nirB。而同化硝酸鹽還原酶小亞基在R.capsulatus、A.vinelandii、P.entomophilaL48和M.capsulatus中命名為nirD，在P.denitrificans命名為nasG，在B.subtilis命名為nasE。根據基因相似度將P.stutzeriA1501中同化亞硝酸鹽還原酶大、小亞基編碼基因暫命名為nirB和nirD。

編碼尿卟啉-Ⅲ C-甲基轉移酶編碼基因在R.capsulatus菌中命名為cysG；在A.vinelandii菌中命名為nasH，在B.subtilis中命名為nasF。根據序列比對結果將P.stutzeriA1501暫命名為cobA。

P.stutzeriA1501同化硝酸鹽/亞硝酸鹽相關基因命名之所以沒有完全按照nas(nitrate assimilation)系列來命名，主要原因有兩點：①學界對同化硝酸鹽/亞硝酸鹽還原相關基因命名比較混亂；②初步研究證明,上述基因參與了同化硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝，但是其中一些基因是否同時參與該菌其他氮代謝途徑還有待進一步研究。盡管在P.stutzeriA1501基因組中存在一套完整的呼吸型亞硝酸鹽還原酶(NIR)編碼基因[39]，但是處于同化硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝基因簇內的亞硝酸鹽還原酶仍有可能同時參與呼吸型亞硝酸鹽還原反應。因此，本研究對P.stutzeriA1501菌同化硝酸鹽/亞硝酸鹽代謝相關基因命名主要基于編碼蛋白的結構特征和序列相似度，不排除今后根據對其功能深入研究后修正基因命名。

3.2 P. stutzeri A1501硝酸鹽同化轉運系統編碼基因分析

基因組序列分析表明，P.stutzeriA1501同化硝酸鹽基因簇中含有兩類硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運系統，分別依賴于質子移動勢的MFS家族蛋白NarK/NasA和ATP驅動的ABC轉運蛋白NasFED。當阻斷nasFED基因表達時，該菌并沒有完全喪失硝酸鹽轉運能力(降低60%)，表明該菌還有其他硝酸鹽轉運途徑，推測是NasA蛋白，需要進一步實驗證明。另外，該菌在硝酸鹽反硝化系統中還存在NarK蛋白和NarM蛋白[39]。盡管目前尚不清楚氮氧化物轉運機制，但已知NarK類蛋白即參與了硝酸鹽的轉運，也參與了亞硝酸鹽的泵出[49]，有些菌株中會存在另一個NarK-like蛋白，例如E.coli中的NarU蛋白，它們的功能并不完全一致，NarU蛋白主要功能是促進亞硝酸鹽泵出[50]。根據保守結構域分析,NasA和NarK、NarM均屬于依賴于質子移動勢類硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運蛋白，但它們的氨基酸序列一致性并不高(<20%)，由于它們處于不同轉錄單元，基因表達受不同蛋白調控，因此推測它們各自在不同系統中發揮作用。同化硝酸鹽還原不同于異化硝酸鹽還原，能力供應較容易獲得，所以ATP驅動的硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運就成為主要方式，因此推測P.stutzeriA1501同化硝酸鹽還原過程中硝酸鹽/亞硝酸鹽的轉運主要依賴于NasFED。

3.3 P. stutzeri A1501硝酸鹽同化特異性調控編碼基因分析

在已報道的同化硝酸鹽/亞硝酸鹽系統中，途徑特異性調控要么由雙組分的NasS-NasT執行，要么由單一組分的NasR執行，目前還沒有關于在同一個菌株中同時存在NasS-NasT和NasR的報道。本研究初步證明在P.stutzeriA1501中，NasS-NasT調控硝酸鹽/亞硝酸鹽還原酶編碼基因的轉錄，NasR調控硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運蛋白編碼基因的轉錄，推測硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運與還原是分開進行的。由于并未發現NasS-NasT與NasR之間具有相互調控作用，因此目前尚不清楚該菌硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運與還原過程的協調機制。