動態濁度法定量檢測注射用氟氧頭孢鈉中細菌內毒素的含量

季文君,方 韻,戴國英,陳 莉

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104)

1988年日本鹽野義制藥株式會社研發上市的注射用氟氧頭孢鈉(flomoxef sodium)是一種新型的氧頭孢烯類廣譜抗生素，其對厭氧菌、革蘭陰性菌及革蘭陽性菌均有很強的抗菌作用[1-2]。臨床上主要用于治療敏感致病菌引起的中重度感染(包括呼吸道感染、尿道感染、婦科感染、外科感染及兒科感染等)[3-4]。

細菌內毒素是一種脂多糖物質，存在于革蘭陰性菌細胞壁上，細菌死亡或自溶后會進入機體，并刺激單核巨噬細胞生成多種細胞因子，過量會引起發熱、低血壓、多器官功能衰竭等一系列熱原反應[5-6]。因此，細菌內毒素檢查是保障注射劑用藥安全的重要參數之一。目前，內毒素檢查方法使用的主要為凝膠法，為定性或半定量的方法，無法獲得內毒素的準確含量。近年來，隨著藥品安全性檢查和生產過程質控的要求日益嚴格，定性或半定量的方法已經無法滿足質控和檢驗的要求。因此，本試驗參照2020年版《中國藥典》四部通則中細菌內毒素檢查法[7]，通過標準曲線的可靠性試驗和干擾預試驗，開發了用于氟氧頭孢鈉的內毒素定量檢測動態濁度法，對注射用氟氧頭孢鈉的細菌內毒素進行定量檢測。同時，本研究對方法的準確性和精密度進行了驗證，探索使用該方法對注射用氟氧頭孢鈉中細菌內毒素進行定量檢測的可行性，為產品生產過程中的內毒素含量監控和成品的檢查提供技術支持。

1 材料

1.1 藥品與試劑

細菌內毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號150601-201782，效價60 EU/支)；細菌內毒素檢查用水(湛江安度斯生物有限公司，批號1605250，規格30 ml/瓶)；動態濁度法鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司，批號1701221，規格1.25 ml/支，檢測范圍50～0.005 EU/ml)；細菌內毒素檢查反應板(湛江安度斯生物有限公司，批號1702140)；注射用氟氧頭孢鈉(日本鹽野義制藥株式會社，批號DC24、DC25、DC26，規格1 g)。

1.2 儀器

ELX808IV細菌內毒素定量儀(美國BioTek公司)；TZL-5009可調速旋渦混勻器(蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司)。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的確定

根據公式計算注射用氟氧頭孢鈉的細菌內毒素限值(L)。L=K/M，其中K為細菌內毒素閾劑量，注射劑，K=5 EU/(kg·h)；M為臨床患者每千克體重每小時的最大供試品用量，成人體重按60 kg計算[7]。注射用氟氧頭孢鈉臨床每次最大用量為2 g，靜脈滴注30～60 min。據此計算，本品的細菌內毒素限值。見公式1。

公式(1)

但是經查閱日本藥局方第17版規定，注射用氟氧頭孢鈉的細菌內毒素限值為0.025 EU/mg[8]。因此，為了用藥安全，本研究選用較為嚴格的0.025 EU/mg作為本品的限值。

2.2 標準曲線的可靠性考察

取細菌內毒素檢查(BET)用水1 ml對細菌內毒素工作標準品進行復溶，并進一步稀釋，使其細菌內毒素最終濃度為1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，各取0.1 ml加入到無熱原反應板中，再加入0.1 ml動態濁度法鱟試劑，混合均勻后立刻放入到細菌內毒素定量儀中進行檢測，每一濃度平行做3個復孔；同時用BET水作陰性對照，平行2個復孔。根據表1得到的標準曲線回歸方程logT=6.00-0.258logC，相關系數r=0.999>0.980，各平行孔的變異系數(CV)均<10%，陰性對照(NC)的反應時間大于規定檢測時間，故標準曲線成立。

表1 細菌內毒素標準曲線及可靠性 n=3

2.3 最大有效稀釋倍數的確定

在試驗中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數就是供試品的最大有效稀釋倍數(MVD)，通常用MVD=cL/λ公式來計算，其中c為供試品溶液的濃度[7]，取1瓶注射用氟氧頭孢鈉(1 g)用10 ml BET水復溶，c初始為100 mg/ml；L為供試品注射用氟氧頭孢鈉的細菌內毒素限值，L=0.025 EU/mg；λ為動態濁度法中標準曲線最低點濃度0.01 EU/ml。經計算，MVD為250倍。見公式2。

公式(2)

2.4 供試品干擾預試驗

取批號為CD24的氟氧頭孢鈉作為干擾預試驗的供試品，用10 ml BET水復溶，再根據MVD的結果，用BET水依次稀釋5(20 mg/ml)、25(4 mg/ml)，50(2 mg/ml)和250倍(0.4 mg/ml)，作為供試品溶液的4個梯度，同時制備含上述供試品濃度并含內毒素濃度(λm)0.25 EU/ml的溶液作為供試品回收溶液，分別取上述供試品溶液、供試品回收溶液、陰性對照溶液和系列濃度的標準品溶液進行檢測，每一濃度平行2個復孔。根據標準曲線回歸方程計算供試品回收溶液中細菌內毒素的含量，并確定內毒素的回收率。

表2結果顯示，供試品溶液濃度為20 mg/ml時，回收率低于50%，存在干擾作用；供試品溶液濃度為4、2和0.4 mg/ml時，內毒素回收率分別是90%、91%和105%，均在50%～200%范圍內。本研究選擇內毒素的回收率最接近100%的0.4 mg/ml作為檢測濃度，此時對檢測結果的干擾較小。

表2 干擾預試驗的結果

2.5 準確性驗證

取批號為CD24的供試品，用10 ml BET水復溶后，稀釋250倍制備成濃度為0.4 mg/ml的供試品溶液，同時制備含有不同濃度內毒素標準品的供試品回收溶液,使其中標準內毒素終濃度分別為1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，氟氧頭孢鈉含量為0.4 mg/ml。測定2個復孔，計算細菌內毒素的回收率以及CV。

結果顯示，含不同濃度標準內毒素的0.4 mg/ml注射用氟氧頭孢鈉供試品的內毒素回收率在87%～120%，均在50%～200%范圍內，且CV均<10%，表明該方法具有較好的準確性，見表3。

表3 動態濁度法的準確性驗證

2.6 精密度驗證

將細菌內毒素工作標準品配制成標準曲線中4個濃度(1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml)的標準內毒素標準溶液，用建立的動態濁度法進行檢測，重復3次獨立試驗，計算每個濃度3次檢驗結果的CV。

結果顯示，CV均<10%，表明該方法的精密性較好，見表4。

表4 動態濁度法的精密性驗證

2.7 供試品的動態濁度法定量檢測

使用細菌內毒素工作標準品制備細菌內毒素標準系列溶液，濃度為1.25、0.25、0.05和0.01 EU/ml，另取BET水作為陰性對照。取3批氟氧頭孢鈉供試品(DC24、DC25、DC26)，按照上述干擾預試驗項下的方法制備濃度為0.4 mg/ml的供試品溶液及供試品回收溶液，用建立的方法檢測，每一濃度平行2個復孔，根據標準曲線計算供試品溶液的內毒素含量，以及供試品回收溶液中內毒素的回收率。

結果顯示，對3批注射用氟氧頭孢鈉進行內毒素檢測，供試品回收溶液中細菌內毒素的回收率均接近100%，供試品溶液均未檢出內毒素，結果符合規定，見表5。

表5 樣品動態濁度法定量檢測結果

3 討論

注射用氟氧頭孢鈉具有抗菌效果好、抗菌譜廣的優點，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有較強的抗菌活性，在臨床上主要用于呼吸系統感染、消化系統感染、泌尿生殖系統感染[9-10]。作為注射劑型，控制其細菌內毒素的含量對于用藥安全有重要意義。

已有文獻報道[11]，可以采用鱟試劑凝膠法檢測注射用氟氧頭孢鈉中的細菌內毒素，但傳統的凝膠法只能進行定性。動態濁度法也是常見的細菌內毒素定量檢測方法，相較于凝膠法具有操作簡便、可定量檢測、檢測范圍寬、準確性好、靈敏度高等優點[12-13]。因此，本研究期望通過建立動態濁度法檢測注射用氟氧頭孢鈉中細菌內毒素含量，從而更好地對產品進行質控。

本研究首先考察了氟氧頭孢鈉本身對細菌內毒素檢查的干擾。結果顯示，高濃度的氟氧頭孢鈉(20 mg/ml)確實對動態濁度法的檢測存在干擾，但是隨著樣品含量的逐漸降低，干擾作用也逐漸減??；當樣品終濃度在0.4 mg/ml時，采用動態濁度法定量測定注射用氟氧頭孢鈉中細菌內毒素含量，回收率最接近100%，對內毒素測定的干擾較小。因此，本文最終選擇0.4 mg/ml的氟氧頭孢鈉作為最終檢測濃度。隨后我們對該方法的準確性和精密度進行了驗證，結果顯示其具有較高的準確性和精密度。采用該方法對3批注射用氟氧頭孢鈉的細菌內毒素含量進行檢測，內毒素含量均小于檢測限，檢查結果符合規定。

由此可見，動態濁度法可以用于注射用氟氧頭孢鈉中細菌內毒素含量的定量測定，且該方法靈敏度高、重現性好，可以更好地滿足產品細菌內毒素的質量控制要求。