結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c在結核病血清學診斷中的價值

韓俊壘，胡建平，邊紅芝

（河南省胸科醫院 呼吸內科，河南 鄭州 450002）

結核病是一種傳染性疾病，在世界范圍內均廣泛流行，對人類身體健康有著嚴重的負面影響，特別是在發展中國家，疾病帶來的影響更為明顯。據統計，結核分枝桿菌在人群中潛伏性感染率約為1/3，我國國內結核病的年新增病例數約為130萬例，在全世界結核病患病總例數中占比約為14%，居第二位，可見我國結核病發病的嚴峻性[1]。目前，結核病的主要感染源依然是活動性肺結核，故早期鑒別診斷活動性肺結核與潛伏性肺結核對結核病的有效控制極為關鍵[2]。結核病主要的診斷方法包括血清學、細菌學與分子生物學三種，其中血清學診斷具有價格低廉、操作簡單、無需借助精密儀器、可在基層醫院展開等諸多優點，但其仍存在缺乏高效價特異性抗原、靈敏度低等局限[3,4]。故越來越多的研究關注相關抗原蛋白融合表達或多種抗原聯合診斷在結核病血清學診斷中的應用價值。本研究基于上海交通大學醫學學員國家“十二五”專項研究，通過在國際上首次引入仿生親和免疫組學，篩選出4個候選蛋白T細胞新型標志物（Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c），分析這些蛋白抗原用于輔助結核病血清學診斷的價值，旨在為未來結核特異性T細胞檢測的臨床診斷及疫苗設計提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 納入對象 選擇我院2016年12月-2018年12月河南省胸科醫院結核科與呼吸科接診的234例活動性肺結核患者作為結核組；選擇同期我院接診的非結核病其他肺部疾病者128例作為其他肺部疾病組；選擇同期河南省中醫學院一附院接受常規體檢的110例健康人群作為健康組。結核組患者均符合《肺結核診斷和治療指南》[5]中相關診斷標準：⑴有咳嗽、咯血、咳痰、發熱、納差、盜汗、疲倦、體重減輕、頭痛、胸痛、呼吸急促等結核病主要癥狀；⑵胸部CT或X線證實存在結核病變；⑶痰培養或涂片結果為陽性；⑷支氣管鏡檢查確診；⑸PPD強陽性；⑹抗結核治療有效；⑺病理確診。其他肺部疾病組患者有咳嗽、咳痰等表現，但均接受相應檢查排除結核病或經一段時間抗結核治療無效；健康組人群均經全身體檢證實為健康人，無結合病史或其他肺部疾病史。排除：⑴合并血液系統疾病者、惡性腫瘤疾病者、免疫系統疾病者；⑵合并肝腎功能衰竭者；⑶合并精神疾病或心理障礙等無法很好的配合研究者。本次研究的設計獲得我院倫理委員會批準同意，且全部入選者及其家屬對此次研究設計的內容均知情，并簽署知情同意書。

1.2 一般資料 結核組男性患者131例，女性患者103例；年齡38～65歲，平均（48.12±5.11）歲；體質量44～75kg，平均（60.21±6.31）kg；受教育程度：75例小學及以下，109例初中或中專，50例高中及以上。其他肺部疾病組男性患者72例，女性患者56例；年齡40～65歲，平均（49.11±5.27）歲；體質量45～74kg，平均（61.11±6.21）kg；受教育程度：41例小學及以下，60例初中或中專，27例高中及以上。健康組男性61例，女性49例；年齡36～65歲；平均（47.84±5.81）歲；體質量45～75kg，平均（61.02±6.01）kg；受教育程度：35例小學及以下，51例初中或中專，24例高中及以上。3組納入者性別、年齡、體質量、受教育程度等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性。

1.3 方法

1.3.1 實驗主要試劑與材料 購自上海奧普生物醫藥有限公司結核抗體檢測試劑盒，采用膠體金法。購自天津希恩思生化科技有限公司的辣根過氧化物酶；北京科科躍中楷生物技術公司提供的化學發光底物液；北京索萊寶科技提供的吐溫-20 500mL，杭州四季青生物工程提供無支原體新生牛血清；中國醫藥公司提供碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀。

1.3.2 配制試劑 包括抗原包被液、磷酸鹽緩沖液、洗滌液、封閉液。

1.3.3 主要儀器SANYO提供的MCO-15AC型37°培養箱；北京東聯哈爾儀器提供的BCN-1360型生物潔凈工作臺；德國BRAND提供的移液器；北京科美東雅提供的化學發光儀；北京拓普儀器提供的DEM-3型全自動洗板機；德國eppendorf提供的5418xp811917型離心機。

1.3.4 結核分枝桿菌重組蛋白抗原的測定 嚴格按照各試劑盒操作要求，同時嚴格根據《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行相關的操作[6]。主要操作包括：篩選各抗原陽性血清標本、確定最佳酶標二抗稀釋度、確定各抗原最佳包被濃度、采用化學發光酶免疫測定法（CLEIA法）測定血清內抗結核抗體、使用試劑盒測定血清內抗結核抗體、涂片培養。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件處理數據，以表示計量資料，用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，以百分比表示計數資料，用χ2檢驗，繪制受試者工作曲線，以特異性為90%時的抗原水平發光值作為結核病診斷臨界值，計算各抗原的靈敏度與特異性，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組人群血清各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較 經化學發光酶免疫法測定血清結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c水平表達結果顯示，結核組患者各血清結核分枝桿菌蛋白抗原水平表達最高，后由高至低依次為其他肺部疾病組、健康組，結核組與其他兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；其他肺部疾病組與健康組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組人群血清各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較（）

表1 3組人群血清各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較（）

注：a：與結核組比較，P＜0.05。

組別 Rv2041c（pg/ml） Rv1419（pg/ml） Rv2991（pg/ml） Rv3428c（pg/ml）結核組（n=234）其他肺部疾病組（n=128）健康組（n=110）FP 152714.36±25021.11 38421.02±4369.77a 36421.47±7761.42a 2372.197＜0.001 191712.79±28710.21 31201.31±4321.84a 25714.49±4601.24a 3740.966＜0.001 114910.96±9261.45 27510.56±2611.45a 24301.45±4114.17a 9637.433＜0.001 190310.46±21001.22 41621.22±7071.44a 37210.47±5000.12a 5761.978＜0.001

2.2 結核病組痰菌陰性與痰菌陽性者各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較 全部234例結核組患者中,檢出痰菌陽性者168例,占比為71.79%,其他66例均為痰菌陰性，陰性率為28.21%。痰菌陰性組與痰菌陽性組各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 結核病組痰菌陰性與痰菌陽性者各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較（）

表2 結核病組痰菌陰性與痰菌陽性者各結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達比較（）

組別 Rv2041c（pg/ml） Rv1419（pg/ml） Rv2991（pg/ml） Rv3428c（pg/ml）痰菌陰性組（n=66）痰菌陽性組（n=168）t P 141567.41±24125.37 146962.47±25241.45 1.490 0.138 184597.78±30214.56 190214.11±31457.89 1.243 0.215 109689.88±90145.69 121567.41±93021.44 0.887 0.376 185697.89±22457.15 192144.73±30001.21 1.580 0.116

2.3 4種結核分枝桿菌重組蛋白抗原水平表達在結核病血清學診斷中的ROC曲線分析

2.3.1 Rv2041c在結核病血清學診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標、特異性作為橫坐標繪制ROC曲線（見圖1），以特異性為90%時Rv2041c發光值為69657.50作為結核病診斷陽性臨界值，在全部234例結核病患者中，陽性者165例，靈敏度為70.51%（165/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽性者17例，特異度為86.72%（111/128）；110例健康組人群中，陽性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度分別為86.97%。

圖1 Rv2041c檢測的ROC曲線圖

2.3.2 Rv1419在結核病血清學診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標、特異性作為橫坐標繪制ROC曲線（見圖2），以特異性為90%時Rv1419發光值為45650.50作為結核病診斷陽性臨界值，在全部234例結核病患者中，陽性者173例，靈敏度為73.93%（173/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽性者22例，特異度為82.81%（106/128）；110例健康組人群中，陽性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度為84.87%。

圖2 Rv1419檢測的ROC曲線圖

2.3.3 Rv2991在結核病血清學診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標、特異性作為橫坐標繪制ROC曲線（見圖3），以特異性為90%時Rv2991發光值為41250.50作為結核病診斷陽性臨界值，在全部234例結核病患者中，陽性者176例，靈敏度為75.21%（176/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽性者17例，特異度為86.72%（111/128）；110例健康組人群中，陽性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度為86.97%。

圖3 Rv2991檢測的ROC曲線圖

2.3.4 Rv3428c在結核病血清學診斷中的ROC曲線分析 以敏感性作為縱坐標、特異性作為橫坐標繪制ROC曲線（見圖4），以特異性為90%時Rv3428c發光值為71569.50作為結核病診斷陽性臨界值，在全部234例結核病患者中，陽性者159例，靈敏度為67.95%（159/234）；128例其他肺部疾病患者中，陽性者15例，特異度為88.28%（113/128）；110例健康組人群中，陽性者14例，特異度為87.27%（96/110）。整體特異度為87.82%。

圖4 Rv3428c檢測的ROC曲線圖

3 討論

結核病細菌學檢查是結核病診斷金標準，但在臨床實際中，標本的涂片、鏡檢靈敏度較低[7,8]。血清結核抗體檢測具有標本來源方便、操作簡單方便、檢測結果快速等優點，現被廣泛用于臨床，但靈敏度、特異度仍較低[9]。因此近幾年國內外相關研究將研究方向轉至蛋白抗原融合表達與多種蛋白抗原聯合檢測上。

Alito等[10]在2003年的研究結果指出，有接近90%的患者其血清內存在至少1種結核抗體，且患者體內抗體表達的種類、數量與水平可以隨著患者疾病不同階段、免疫背景與菌株的不同而有明顯區別。結核病抗體反應針對的結合抗原是多種多樣的，任何抗原單獨檢測均無法完全測定結核病患者全部的血清結核抗體，故聯合檢測多種抗原，可以在確保特異性的基礎上幫助診斷敏感性提高[11,12]。本研究就主要的4種結核分枝桿菌重組蛋白抗原（Rv2041c、Rv1419、Rv2991和Rv3428c）用于結核病血清學診斷的價值進行相關研究。

結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c基因（ID 887474）編碼蛋白質主要由439個氨基酸殘基所組成，屬糖脂蛋白，主要由結核分枝桿菌H37Rv在體外缺氧、低pH的條件下高效表達產生[13,14]。本研究結果顯示，結核分枝桿菌Rv2041c可誘導結核病患者分泌高水平抗體，這與Garmory等[15]研究結果一致。本研究單獨將結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c用于結核病的血清學診斷，結果顯示，該蛋白測定結核抗體特異度為86.97%，有著較高的特異度，可見結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2041c是一種相對理想的結核病血清學診斷抗原。Rv1419是凝集素的一種，主要由結核分枝桿菌所分泌，是一種糖蛋白，僅在結核分枝桿菌復合群內有表達，在其他的分枝桿菌中午表達[16-18]。Singh等[19]在2007年采用生物信息學鑒定并分析了分枝桿菌主要的11種凝集素，結果證實，Rv1419的分子量最小，該研究還證實了Rv1419會引起兔紅細胞的凝集，并對活性肺結核患者外周單核核細胞產生刺激，導致其γ-干擾素處于高水平；此外，該研究還在活動性肺結核患者的外周血中檢測除了高滴度抗Rv1419 IgG抗體，而在給予患者合理的抗結核治療后，其對應的抗體滴度降低。可見Rv1419對結核病評價的重要意義。本研究所得結果與上述研究結果一致，表明結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv1419可以刺激結核病患者抗體呈高水平狀態，該抗原用于結核病診斷的靈敏度與特異度均理想，可考慮將其用于結核病的血清學診斷中。Rv2991與Rv3428c是近幾年新發現的結核分枝桿菌重組抗原蛋白類型,前者已被證實用于結核病早期診斷有一定價值,且在特定的靈敏度下,其用于結核病血清學診斷的特異度相對較高[20]。該結果與本研究所得結果一致。目前，與結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv3428c用于結核病血清學診斷的相關研究國內外均不多見,該蛋白抗原的相關機制、分子量等情況也尚未明確，本研究結果顯示，將Rv3428c蛋白抗原用于結核病血清學診斷的特異度為87.82%，特異度較高，可以考慮將其與其他抗原蛋白聯合使用，以提高結核病早期鑒別診斷準確率。但因上述結核分枝桿菌重組蛋白抗原用于結核病早期血清學診斷相關循證學依據較少，故本研究中所得的結果與結論還應在未來進一步展開大樣本、長時間的研究加以證實。

綜上所述,結核分枝桿菌重組蛋白抗原Rv2 041c、Rv1419、Rv2991、Rv3428c輔助結核病的血清學診斷均有著較高的特異度，臨床實際中，可將各抗原聯合檢測，以提高抗結核抗體檢測敏感度，提高結核病的檢出率。