實時熒光PCR與DNA測序技術檢測手足口病病毒結果分析

盧艷玲

（濟源市疾病預防控制中心微生物檢驗科，河南 濟源 459000）

手足口病是臨床的多發病和常見病，具有較高的傳染性和流行性，通常發生在夏秋季節，以5歲以下的嬰幼兒最為常見。其中，以手、足部出疹，口腔黏膜皰疹或潰瘍等為特征性表現[1]。一般情況下患兒在發病的5～7天自行緩解，也有少部分患兒會發展至重癥，即在發病后的1～4天出現腦膜炎、腦炎、脊髓炎、腦脊髓炎等中樞神經系統受累并發癥，甚至伴有肺水腫、肺出血及循環衰竭等癥狀。危重癥患兒與輕癥患兒不同，因其病情進展較快，，若不及時接受有效治療，可危及生命安全。目前臨床上診斷手足口病的金標準為病毒分離培養，雖然準確率高，但價格昂貴，檢測時間長，對微生物實驗室基礎設備要求高，并不適合大規模推廣，因此尋求一種操作簡單、方便、費用低、準確率高、靈敏度高的檢查方法十分必要[2]。有學者建議采用實時熒光PCR與DNA測序技術檢測手足口病病毒，但國內對于它們的對比性研究較少，尚不清楚哪種方法的確診率高。故本次對126例疑似感染手足口病患兒采用實時熒光PCR與DNA測序技術檢測，探討其對確診率、敏感度、特異度的影響。報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 前瞻性選取2017年03月-2019年06月收治的126例疑似感染手足口病患兒進行研究，經病毒分離培養確診為手足口病共92例，均給予實時熒光PCR與DNA測序技術檢測。其中男性患兒62例、女性患兒64例；年齡范圍2～11歲，平均5.71歲；病程范圍3～7d，平均4.45d。

診斷標準：符合“手足口病診療指南(2018年版)”[3]診斷標準，譬如伴有口痛、厭食、低熱及手足口等部位出現小皰疹等表現，經病毒分離培養確診。

納入標準：⑴經醫院倫理委員會批準；⑵無藥物禁忌癥；⑶年齡大于或等于2歲；⑷家屬同意參加本次研究；⑸無肺部感染性疾病。

排除標準：⑴伴有嚴重先天性心臟病；⑵哭鬧情緒較為嚴重，無法配合操作。

1.2 方法 ⑴標本采集與制作：用無菌棉球采集本次所有受檢者咽拭子標本，采集完畢后將其標本保存在采樣瓶中，盡快倒入病毒保存液，在4℃的環境下保存及時送檢。

⑵病毒分離培養：將所有采集的咽拭子標本接種到健康的單層RD細胞中，每份標本接種0.2ml，在33攝氏度的環境下培養；其次采用顯微鏡觀察細胞，并記錄細胞所發生的變化；若是在觀察期間發生有特征的腸道病毒CPE出現，且高達70%左右，則將其儲藏在-20℃的環境下以備二次傳代；若是觀察7d后無腸道病毒CPE出現，則應該盲傳一代繼續觀察，盲傳二代仍是沒有出現腸道病毒CPE，則將其判定為陰性。

⑶實時熒光PCR檢測：采用生理鹽水對所有的標本重懸，再取1.5ml放置在無菌離心管中，并加入Trizol試劑200μl與氯仿100μl，通過振蕩器離心振蕩20s、靜置3min后12000r/min冷凍離心2min，提取上清液，提取完畢后在上清液中加入10PLRNA提取液A，再次通過振蕩器將溶液混合均勻，充分混勻后8000r/min冷凍離心1min，其目的是為了棄除上清液，而剩余的溶液放置在通風櫥中，通風時間為15min，待瓶中出現白色沉淀物后加入DEPC 30μl，對其輕輕搖晃，待充分混勻后呈白色懸濁液進行PCR擴增；最后在PCR反應管中加入逆轉錄酶系2μl、Taq酶系3μL及RT-PCRl反應液5μl，加入完畢后再加入陰、陽性質控液與RNA標本懸濁液，其中PCR反應管總體積控制在25μl左右，8000r/min離心，待離心處理完畢后采用實時熒光PCR儀進行擴增檢測。熒光PCR檢測試劑盒由上海科華生物工程股份有限公司提供。

⑷DNA測序：采用貝克曼DNA測序儀檢測，病毒DNA提取試劑盒由西安天隆生物科技有限公司提供，按照說明書執行操作。

1.3 觀察指標

1.3.1 評估實時熒光PCR檢測與DNA測序的陽性預測值、陰性預測值。采用四格表法計算。

1.3.2 評估上述方法對手足口病毒亞型的檢出情況，包括腸道病毒通用型（EV）檢出率、腸道病毒71型（EV-71）檢出率、柯薩奇病毒A16（CA-16）。

1.3.3 評估上述方法的準確率、漏診率、誤診率。

1.3.4 評估實時熒光PCR、DNA測序技術診斷手足口病的AUC、敏感度、特異性及約登指數。

1.4 統計學分析 采用SPSS22.0軟件分析本次數據。計量資料用（）表示，行獨立樣本t檢驗；計數資料用（n；%）表示，行χ2檢驗；診斷價值采用ROC曲線分析；P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 手足口病病原體分型 在126例疑似感染手足口病患兒中，經病毒分離培養確診為手足口病共92例、百分比為73.02%；其中，檢出為EV病毒共48例、百分比為52.17%，檢出EV-71病毒共32例、百分比為34.78%，檢出CA-16病毒共16例、百分比為17.39%。

2.2 實時熒光PCR的陽、陰性預測值分析126例疑似感染手足口病患兒經實時熒光PCR檢測后陽性預測值為96.77%、陰性預測值為93.94%；與金標準齊同（P＞0.05）。見表1。

表1 實時熒光PCR的陽、陰性預測值比較

2.3 DNA測序技術的陽、陰性預測值分析126例疑似感染手足口病患兒經DNA測序技術檢測后陽性預測值為83.53%、陰性預測值為48.78%；低于金標準（P＜0.05）。見表2。

表2 DNA測序技術的陽、陰性預測值比較

2.4 手足口病毒亞型的檢出情況126例疑似感染手足口病患兒經實時熒光PCR檢查后確診為手足口病共90例，其中感染EV病毒47例、EV-71病毒31例、CA-16病毒12例；經DNA測序技術檢查后確診為手足口病共71例，其中感染EV病毒38例、EV-71病毒20例、CA-16病毒13例。見表3。

表3 不同檢查方法對手足口病毒亞型的檢出情況（n；%）

2.5 準確率、漏診率、漏診率比較 實時熒光PCR的準確率高于DNA測序技術，而誤診率、漏診率低于DNA測序技術（P＜0.05）。見表4。

表4 兩種檢查方法的敏感度、特異度、準確率比較（n；%）

2.6 ROC曲線分析ROC曲線分析顯示，實時熒光PCR、DNA測序技術診斷手足口病的AUC分別為（0.945、0.680，P＜0.05）；依據AUC及標準誤，采用Z檢驗AUC差異，結果顯示實時熒光PCR VS DNA測序技術Z=4.171、P＜0.001；其中敏感度分別為97.80%、77.20%，特異度分別為91.20%、58.80%。見表5，ROC曲線見圖1。

表5 診斷效能分析

圖1 實時熒光PCR與DNA測序技術的ROC曲線分析

3 討論

手足口病是一種急性傳染病，由多種腸道病毒感染所引起，譬如柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型等病原體[4]。經調查發現，腸道病毒71型會導致患兒發生中樞神經系統病變，如腦膜炎、腦脊髓炎等，甚至因中樞神經系統、循環系統、呼吸系統損害而死亡[5]。基于此，盡早診治顯得十分重要，對控制病情發展及挽救患兒生命安全具有重要意義。目前臨床上針對該病，多采用病毒分離培養、DNA測序技術、實時熒光PCR等方法檢測。其中，第一種方法為臨床診斷手足口病的金標準，雖然診斷確診率較高，但因檢測周期長，無法滿足早診斷、早治療的目標[6]。第二種方法是分子生物學研究中最為常用的技術之一，盡管測序法可達到一定通量，但因設備特殊、昂貴、操作步驟繁瑣及結果判讀復雜，對環境和操作者要求高，導致該項檢查無法大規模推廣。而第三種是通過檢測手足口病患兒的咽拭子、糞便等標本，行病原體診斷，具有操作簡單、方便、穩定性良好等特點[7]。另外，它也是一種新興的分子生物檢測方法，通過在線實時監測，避免人為判斷[8-10]。

研究結果顯示，126例疑似感染手足口病患兒經實時熒光PCR檢測后，其陽性預測值為96.77%顯著高于DNA測序技術檢測后的陽性預測值；并且實時熒光PCR檢測的陽性預測值較接近“金標準”，提示實時熒光PCR診斷確診率更高。其中，DNA測序技術陽性預測值較低可能與病毒缺失有關，加上基因突變圖譜復雜，導致標本需在基因克隆的前提下，確定其突變類型，否則難以檢測到病毒[10-12]。在敏感度、特異性及準確率方面，本研究發現實時熒光PCR更高，但也存在假陰性情況，即假陰性出現3例；為了避免該情況的發生，建議在實時熒光PCR檢測結束后，將PCR產物放置在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現擴增產物，則可排除假陰性的可能[13]。另外，實時熒光PCR所采用96孔板實時PCR儀器，同時能檢測48個標本，甚至更多，且檢測時間較短，能在2h內完成；而DNA測序技術無法做到，需要進行擴增、純化、序列分析等步驟，故耗時較長[14,15]。并且檢測費用及其成本比實時熒光PCR高，故本文更建議采用實時熒光PCR檢測方法，在其ROC曲線分析中，發現實時熒光PCR的AUC值高于DNA測序技術，提示前者診斷價值更高。

綜上所述，實時熒光PCR與DNA測序技術檢測相比，前者更加快捷，且靈敏度、特異度更高，能滿足臨床需求。