染色體核型分析聯合熒光原位雜交技術對兒童急性髓系白血病M2的診療意義

李林飛，宋銀森，李東曉，李嫻，趙鼎

（鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室 鄭州兒童醫院，河南 鄭州 450000）

急性髓系白血病M2型(acute myeloid leukemia-M2,AML-M2)是一類髓系造血干/祖細胞惡性克隆性疾病，其致病基礎主要是細胞及分子遺傳學異常[1]。t(8;21)是急性髓系白血病M2的一種常見非隨機染色體重排，具有較強的規律性[2]，其易位的產生導致AML1基因重排可作為急性髓系白血病M2基因診斷的標志。核型分析和FISH技術是常用的白血病檢測的遺傳學手段，本研究旨在深入探討兩種方法在AML-M2診治及預后中的應用價值及方法學特點。

1 資料與方法

1.1 對象2017年7月至2019年3月在我院血液腫瘤科住院的急性髓系白血病M2型兒童25例，男10例，女15例，均經FAB骨髓形態學及免疫學分型等標準確診。本研究通過鄭州兒童醫院倫理委員會批準，并均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析 在無菌條件下,抽取患兒骨髓液至少3ml，肝素鋰管抗凝，接種于淋巴細胞培養基中，37℃培養2天左右。加入秋水仙素后繼續培養數小時后收獲，常規制備染色體玻片，G顯帶，分辨率400～450條帶。用Leica GSL-10全自動工作站，計數20個分裂相，分析5個左右核型，當核型結果不一致時，根據相關標準擴大計數量并加數核型。按照人類細胞遺傳學國際命名體制ISCN2009加以描述。

1.2.2 熒光原位雜交技術 應用熒光原位雜交(FISH)檢測，采用AML1/ETO雙融合基因探針(英國Cytocell公司),ETO(8q22)基因探針標記為綠色，AML1(21q22)基因標記為紅色。在Leica GSL-10全自動工作站熒光顯微鏡下觀察間期細胞雜交信號,Cytovision軟件進行熒光圖像分析，共計數200個細胞雜交信號，陽性細胞所占比例達10%以上可提示陽性結果。正常細胞內顯示的雜交信號為2個綠色及2個紅色信號，均不在同一點上，無融合信號發生；發生AML1/ETO融合的陽性細胞內至少顯示一個以上黃色融合信號。

1.3 統計學方法 數據處理采用SPSS21.0統計軟件，兩種方法學比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

在25例AML-M2兒童中，核型分析檢出t(8;21)染色體易位17例(68%)，包括除典型t(8;21)及其它染色體異常，如復雜易位、缺失、額外染色體等，核型正常5例(20%),其中4例為復診兒童,3例(12%)標本因細胞生長不良，制片質量差，無法分析；25例AML-M2兒童同時做FISH，檢出陽性20例(80%)，包括17例t(8;21)及3例無分裂相的標本，4例復診兒童均為陰性，檢出信號異常1例(4%)，但無陽性改變。17例AML-M2兒童易位染色體核型見表1。

表1 17例AML-M2兒童易位染色體核型分布

本研究中染色體核型分析對t(8;21)的檢出率與熒光原位雜交(FISH)對AML1/ETO融合基因的檢出率進行比較，差異并無統計學意義（χ2=0.936，P=0.333)，見表2。

表2 兩種方法檢出率比較

3 討論

伴t(8；21)染色體易位或AML1-ETO融合基因陽性急性髓系白血病已被世界衛生組織劃分為獨立亞型,出現在約10%～20%兒童急性髓系白血病病例中[3]，為目前兒童AML最常見的分子細胞遺傳學改變，具有高度的異質性[4],臨床表現有發熱、鼻衄、面部蒼白、皮膚瘀斑、黏膜出血點、血象異常等，多見髓外侵犯,常伴有附加核型異常[5]。

t(8；21)/AML1-ETO融合基因陽性常見于兒童AML的FAB分型中M2型，尤其在M2b亞型中出現率高達80%以上，M1,M4亦可見，偶見于骨髓增生異常綜合癥（MDS）[6]。M2b主要是以異常的中性中幼粒細胞為主[7]，因此類患者化療完全緩解率較高，生存期也較長，其被認為是預后良好組。分子及細胞遺傳學檢測對于AML-M2臨床診治及預后具有重要的臨床意義。

AML1/ETO融合基因是由于21號染色體上的急性白血病因子(acute myelogenous leukemia factor1,AML1 or RUNX1)基因易位至8號染色體上的白血病易位基因（myeloid translocation gene,ETO）而產成[8]，這種遺傳學改變形成融合轉錄本RU NX1-RUNX1T1，破壞了核心結合因子復合物的α亞基，進而產生AML1/ETO融合蛋白，該融合蛋白能夠對正常造血細胞的增殖、分化和凋亡產生干擾,從而構成了t(8;21)陽性AML發病的重要基礎[9]。

本研究25例AML-M2兒童G顯帶檢出t(8；21)染色體易位17例(68%)，核型正常5例(20%)，且有3例(12%)標本因細胞生長不良，制片質量差，無法分析。而FISH檢測不受細胞培養條件及實驗室環境影響，可以分析處于各個分裂期的細胞，只需觀察熒光信號均可做出結果判讀,大大降低結果分析的難度，檢測方法更加客觀、特異、省時[10]。對于17例t(8;21)染色體易位及3例無分裂相的標本,FISH檢測均提示陽性,表明FISH探針檢測用于AML-M2診斷較染色體核型分析有一定技術優勢,能夠降低漏檢率特別是對于無分裂相或分裂相稀少不足以顯示克隆性染色體重排的病例,進而為臨床診斷和治療提供重要信息。但本研究中兩種方法的檢出率比較，差異并無統計學意義，可能跟此易位染色體相關白血病染色體畸變G顯帶技術較易檢出及標本量有關。此外，4例復診兒童，FISH結果均為陰性,表明FISH檢測在AML-M2預后的療效監測中同時具有一定用途。

綜上所述,急性髓系白血病M2患兒特異性t(8；21)/AML1-ETO融合基因陽性改變較易檢出，FISH技術檢測患兒易位的敏感性較高于染色體核型分析。FISH檢測不僅可以提示融合基因是否陽性,也可提示特定基因是否異常。染色體核型分析可同時提示相關染色體是否易位及其余染色體有無畸變。因此，兩種分析方法聯合應用可多方面提示AML-M2兒童的疾病信息,在AML-M2的診治及預后中具有重要的應用價值。