腦脊液流式細胞學在鑒別診斷小兒急性淋巴細胞白血病并中樞神經系統白血病中價值

陳東玉，黨惠兵，臧玉柱，周可樹

（1.方城縣人民醫院血液腫瘤科，河南 南陽 473200；2.南陽醫專一附院血液科，河南 南陽 473200；3.河南省人民醫院血液科，河南 鄭州 450000；4.河南省腫瘤醫院血液科，河南 鄭州 450000）

急性淋巴細胞白血病 （Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童常見的惡性腫瘤性疾病，約占兒童白血病的70%，隨著化療及分層治療的完善，約80%的兒童可獲得較長生存期[1]。但中樞神經系統白血病的發生可導致患兒死亡率增加，生存期縮短,也是多數ALL患兒治療失敗的主要原因之一[2]。早期診斷中樞神經系統白血病可及時處理和治療，改善患兒生存期[3]，但目前其診斷主要依靠腦脊液腦脊液細胞學（Cerebrospinal fluid cytology，CC）檢查中異型白細胞，CC檢查常受到標本及制片等人為影響,仍存在部分中樞神經系統白血病漏診[4]，提高中樞神經系統白血病檢出率是臨床亟待解決難題。因此本研究觀察腦脊液流式細胞學檢查（Flow cytometry，FCM）在鑒別診斷小兒ALL并中樞神經系統白血病中價值。

1 資料與方法

1.1 患兒資料 選取2013年6月30日至2018年6月30日本院收治的98例首診ALL患兒。選取標準：在我院首診為ALL，既往未接受其他白血病相關治療；符合ALL診斷標準[5]；臨床資料完整；患兒家屬對研究知情且簽署本研究相關同意書。排除合并自身免疫性疾病、其他血液系統疾病（如骨髓增生異常綜合癥等）、先天性疾病、慢性肝臟疾病、慢性腎臟疾病、心臟病、內分泌疾病患兒。

1.2 中樞神經系統白血病診斷標準 可存在中樞神經系統臨床特征：頭痛、抽搐、嘔吐、視網膜出血、口角歪斜、視物模糊以及視乳頭水腫等；腦脊液細胞學檢查見白血病細胞；排除其他疾病（如腦炎）等引起的相似性改變；顱內壓＞0.02kPa，腦脊液中白細胞>106/L。中樞神經系統白血病診斷標準參考[6]。

1.3 檢測方法 患兒均接受腰椎穿刺取腦脊液樣本,要求一次成功，避免穿刺損傷對樣本造成影響。對腦脊液樣本進行常規生化檢測。取第一次腦脊液檢查的標本進行FCM和CC檢查。

1.3.1 CC檢測方法 取0.1ml腦脊液樣本吹打混合均勻，放入離心管，離心1min（200×g），制作腦脊液涂片，并進行瑞氏染色，待自然晾干后放于顯微鏡下觀察涂片中細胞形態。CC陽性指涂片中見幼稚原始白血病細胞，否則為陰性。

1.3.2 FCM檢測方法 取約2ml腦脊液樣本，離心后取沉淀細胞放入試管中，加入紅細胞裂解液。根據免疫分型結果（初診時免疫表型表達最強者）選擇20μl單克隆抗體（美國BD公司提供）加入試管中，室溫避光15min后加PBS定容，進行FCM檢測。患兒均使用CD34及CD45單抗標記。FCM陽性指腦脊液未被血液污染且可檢測到白血病細胞免疫表型或腦脊液混血后白血病細胞免疫表型高于外周血中幼稚細胞，否則為陰性。

1.4 觀察指標 ⑴兩種檢測方法對異形細胞的檢出率。⑵兩種檢查方法對CNS狀態的檢出情況，根據患兒臨床表現、影像學結果及CC結果將ALL分為CNS-1、CNS-2、CNS-3。CNS-1指CC陰性且無CNS相關臨床及影像學表現；CNS-2：腰穿無損傷時CC檢測中白細胞數≤5/μl，且可見白血病細胞，腰穿損傷時CC檢測結果可見白血病細胞或血性腦脊液中白細胞數>50×109/L；CNS-3：CC陽性或出現CNS相關臨床及影像學表現。⑶兩種方法對腦壓增高患兒、腦脊液蛋白陽性患兒、腦脊液血糖增高患兒異常細胞的檢出率。⑷根據患兒病情、年齡、白細胞數、化療反應、微小殘留病、激素預治療反應、免疫分型等將患兒分為標危、高危及中危[6]，比較兩種方法對標危、高危及中危的檢出情況。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0分析數據，FCM和CC檢出率比較使用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒資料98例ALL患兒年齡3～14歲，平均（6.5±2.1）歲，男51例，女47例，隨訪時間12～42月，中位隨訪時間32個月，死亡14例，復發8例，4例放棄治療。共4例患兒確診為中樞神經系統白血病，其中3例FCM陽性且CC陽性，1例FCM陰性且CC陰性。特殊融合基因Tel/AML1 15例，Bcr/ab1 p210 2例，Bcr/ab1 p190 5例，TKD 2例，MLL/AF4 5例。

2.2 FCM和CC對異形細胞的檢出率FCM檢出24例患兒腦脊液中存在異形細胞,檢出率為24.5%；CC檢出11例患兒腦脊液中存在異常細胞，檢出率為11.2%，FCM對異形細胞檢出率高于CC，差異有統計學意義（P＜0.05），表1。

表1 FCM和CC對異形細胞的檢出率

2.3 FCM和CC對不同患兒異形細胞的檢出率在腦脊液蛋白質陽性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒中，FCM對異形細胞的檢出率均高于CC患兒，差異有統計學意義（P＜0.05）。而兩種檢查方法在腦脊液蛋白質陰性、腦壓正常、腦脊液血糖正常患兒中對異形細胞的檢出率差異無統計學意義（P>0.05），表2。

表2 FCM和CC對不同患兒異形細胞的檢出率

2.4 FCM和CC對CNS狀態及危險度的檢出情況FCM和CC陽性患者CNS狀態及危險度分布差異無統計學意義（P＜0.05），但FCM對CNS-1、中度患者檢出率高于CC，差異有統計學意義（P>0.05）。表3。

表3 FCM和CC對CNS狀態及危險度的檢出情況

3 討論

中樞神經系統白血病是小兒ALL治療失敗和疾病進展的重要因素，早期診斷和治療可提高生存期、降低患兒死亡率[7,8]。中樞神經系統白血病的診斷依賴于腦脊液CC檢查發現白血病細胞，但腦脊液中白血病細胞數量較少，且容易受到人為因素的影響，診斷檢出率仍待提高[9]。目前FCM已被AIEOP-BFM共識指南（2016年）推薦用于兒童ALL診斷中，但其在診斷中樞神經系統白血病中價值有待研究[10]。

本研究共納入98例ALL患兒，共4例患兒確診為中樞神經系統白血病，發病率為4.0%，既往研究報道，ALL發生中樞神經系統白血病幾率為2.0%～6.6%，本研究與既往研究報道相符[11]。本研究中4例中樞神經系統白血病患兒中3例FCM陽性且CC陽性，1例FCM陰性且CC陰性，提示FCM和CC診斷中樞神經系統白血病檢出率差異不大，由于本研究病例數較少，中樞神經系統白血病發病率低，該結論仍需進一步證實。1例FCM陰性且CC陰性可能與該患兒腦膜未被腫瘤細胞浸潤造成。

既往研究報道，FCM在成人ALL患者中樞神經系統受累的診斷效果優于傳統細胞學檢查，敏感性更高[12]。本研究結果顯示，FCM對異形細胞檢出率（24.5%）高于CC（11.2%），且在腦脊液蛋白質陽性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒中，FCM對異形細胞的檢出率顯著高于CC患兒,提示FCM在鑒別診斷小兒ALL并中樞神經系統白血病中價值優于CC，尤其是腦脊液蛋白質陽性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒中。譚惠珍等[13]研究報道，FCM檢查診斷ALL中樞神經系統疾病的敏感性高于CC，FCM聯合CC可提高ALL中樞神經系統浸潤的檢出率。Quijano等[14]研究證實，FCM可使ALL中樞神經系統浸潤患兒腦脊液中異型細胞的檢出率提高75%，本研究也證實FCM對異形細胞檢出率更高，與既往研究結果相符。董德明等[15]研究結果顯示，FCM腦脊液檢測對中樞神經系統浸潤檢出率高，尤其是腦壓增高患兒，與本研究結果相符。

本研究中，FCM和CC陽性患者CNS狀態及危險度分布差異無統計學意義（P<0.05）,提示FCM和CC陽性對CNS狀態及危險度分布診斷價值相當，但FCM對CNS-1、中度患者檢出率高于CC，提示FCM對CNS-1及中度危險患兒的敏感性更高。而FCM對CNS-2、CNS-3敏感性與CC相當。楊文鈺等[6]研究證實，腦脊液FCM是CC檢查的重要補充,對CNS-2、CNS-3檢出能力與CC具有高度一致性，與本研究結果相符。但由于本研究為單中心研究，且中樞神經系統白血病發病率低，病例數有限，研究結果仍待進一步證實。

綜上，FCM在鑒別診斷小兒ALL并中樞神經系統白血病中價值優于CC，尤其是腦脊液蛋白質陽性、腦壓升高、腦脊液血糖增高患兒，且對CNS狀態及危險度的敏感性高。