Foxp3基因在URSA患者外周血中的表達及其臨床意義

張小燕，李曉麗，李雪華，黃娟

（1.平頂山市第一人民醫院產房，河南 平頂山 467000；2.平頂山市第一人民醫院婦一科，河南 平頂山 467000）

復發性流產是臨床常見的一種妊娠并發癥，已嚴重影響人類生殖健康，其病因較為復雜，其中一半以上復發性流產患者病因不明,因而稱為原因不明復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1,2]。調節性T細胞 （regulatory T cell，Treg）在正常妊娠的維持中發揮重要調控作用,其中叉頭樣轉錄因子P3（Forkhead box P3，Foxp3）在Treg細胞中特異性表達并可作為標志性分子[3]。既往研究顯示Foxp3基因多態性與URSA的發生密切相關[4,5]。但Foxp3基因在URSA發生過程中的調控作用尚未闡明。因此，本研究主要探討Foxp3基因在URSA患者外周血中的表達及其臨床意義，為URSA的診斷及治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月-2018年9月本院收治的55例URSA早孕婦女作為研究組，所有研究對象符合相關診斷標準：連續2次或超過2次自然流產；無死產、活產史；檢查后無與流產相關的常見發病原因[6]。研究組患者年齡25～45歲，平均年齡33.49±6.12歲。同時選取同期50例正常早孕婦女為對照組，所有婦女均無遺傳與自然流產史，無死胎或解剖，無內分泌異常，懷孕期間未發生生殖道感染，年齡25～42歲，平均年齡32.46±5.29歲。兩組研究對象年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。納入標準：無自然流產史；月經周期規律。排除標準：甲狀腺功能異常者；自身免疫性疾病患者；血小板增多癥患者。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本及分離單核細胞 抽取兩組研究對象次日清晨空腹靜脈血5ml，4℃條件下經3000r/min離心5min，收集血液樣本置于抗凝管內，放入-20℃冰箱內保存。采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMCs），調整細胞密度為1×106個/mL。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測外周血中Foxp3 mRNA的表達水平 采用Trizol法（北京全式金生物技術有限公司）提取外周血中的總RNA。應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度。根據反轉錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書操作將總RNA反轉錄為cDNA。Foxp3正向引物5’-CATCCGCCACAACCTGAGTC TG-3’，反向引物5’-CCTGTTCGTCCATCCTCCTT TCCT-3’；β-actin正 向 引 物5’-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3’，反向引物5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。參照qRT-PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書配置反應體系，反應條件：95℃預變性2min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s,共40次循環。Foxp3以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算Foxp3 mRNA的相對表達量。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測免疫細胞因子水平采用ELISA法檢測免疫細胞因子白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的水平，檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 檢測Th1/Th2型細胞因子水平 采用ELISA法檢測Th1/Th2型細胞因子白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、α干擾素（interferon α，IFN-α）、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）的水平，檢測試劑盒購自北京鼎國生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 流式細胞術檢測外周血PD-1、Tim-3的表達水平 收集PBMCs懸液100μl分別加入5μl CD14-FITC、PD-1-PE、Tim-3-PE，設置同型對照，室溫避光孵育15min,加入2ml Buffer洗滌，4℃條件下經3000r/min離心10min，棄上清，加入Buffer重懸細胞500μl，應用流式細胞儀檢測CD14+單核細胞上T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域3（T cell immuno-globulin and mucin domain 3，Tim-3）與程序性細胞死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）的表達，采用百分比表示。鼠抗人CD14-FITC與PD-1-PE購自美國eBioscience公司;Tim-3-PE購自美國BioLengend公司；同型對照鼠抗人IgG1-FITC/PE購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3 統計學處理 采用統計學軟件SPSS21.0進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用檢驗，采用Pearson法分析URSA患者外周血中Foxp3與免疫細胞因子、Th1/Th2型細胞因子、PD-1及Tim-3的相關性，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者外周血Foxp3基因表達量比較與對照組比較，研究組外周血Foxp3 mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 兩組受試者外周血Foxp3基因表達量比較（）

表1 兩組受試者外周血Foxp3基因表達量比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n對照組研究組50 55 t P Foxp3 mRNA 1.00±0.20 0.52±0.15*13.991 0.000

2.2 兩組受試者外周血免疫細胞因子水平比較與對照組比較，研究組外周血IL-17、IL-6水平顯著升高，TGF-β水平顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者外周血免疫細胞因子水平比較（）

表2 兩組受試者外周血免疫細胞因子水平比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n對照組研究組50 55 tP IL-17（pg/mL）IL-6（ng/mL）225.75±36.52 346.57±56.85*12.813 0.000 43.25±10.03 66.24±16.24*8.624 0.000 TGF-β（ng/mL）708.14±55.24 521.03±36.12*20.721 0.000

2.3 兩組受試者外周血Th1/Th2型細胞因子水平比較 與對照組比較，研究組外周血IL-2、IFN-α、IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-10水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 兩組受試者外周血Th1/Th2型細胞因子水平比較（，μg/L）

表3 兩組受試者外周血Th1/Th2型細胞因子水平比較（，μg/L）

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n IL-2 IFN-α IFN-γ IL-4 IL-10對照組研究組50 55 t P 4.21±0.52 8.32±1.27*21.310 0.000 5.46±1.13 30.21±5.21*32.882 0.000 503.21±46.57 695.48±46.16*21.227 0.000 26.19±3.21 11.71±2.13*27.464 0.000 28.46±3.16 16.58±3.58*17.952 0.000

2.4 兩組受試者外周血PD-1、Tim-3的表達水平比較 與對照組比較，研究組外周血PD-1、Tim-3的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 兩組受試者外周血PD-1、Tim-3的表達水平比較（

表4 兩組受試者外周血PD-1、Tim-3的表達水平比較（

注：與對照組比較，*P<0.05。

組別 n對照組研究組50 55 t P PD-1（%）3.52±0.54 2.03±0.52*14.398 0.000 Tim-3（%）3.50±0.95 2.11±0.62*8.956 0.000

2.5 URSA患者外周血Foxp3與免疫細胞因子、Th1/Th2型細胞因子、PD-1及Tim-3的相關性分析 采用Pearson法分析URSA患者外周血中Foxp3與免疫細胞因子、Th1/Th2型細胞因子、PD-1及Tim-3的相關性，結果顯示Foxp3與IL-17、IL-6、IL-2、IFN-α、IFN-γ呈負相關（P＜0.05），而與TGF-β、IL-4、IL-10、PD-1、Tim-3呈正相關（P＜0.05），見表5。

表5 Foxp3與免疫細胞因子、Th1/Th2型細胞因子、PD-1及Tim-3的相關性分析（r/P）

3 討論

Th1/Th2、Th17/Treg等細胞因子失衡可引起免疫系統異常從而參與自身免疫性疾病等多種疾病的發生及發展過程，研究表明URSA的發生與Th17/Treg細胞失衡有關[7,8]。因而探究Foxp3基因與Th1/Th2、Th17/Treg等免疫細胞因子的相關性具有重要意義。

Foxp3基因位點多態性可增加原發性高血壓發生的風險[9]。研究表明Foxp3基因表達改變可參與自身免疫性疾病的發生過程[10-12]。本研究結果顯示Foxp3基因在URSA患者外周血中表達下調，提示Foxp3基因表達下調可能促進URSA的發生。研究表明Th17/Treg細胞相關因子IL-17、IL-6、TGF-β表達異常與母體及胎兒間免疫耐受、良好的妊娠結局密切相關[13]。本研究結果顯示研究組患者外周血中IL-17、IL-6水平顯著升高，而TGF-β水平顯著降低，進一步分析顯示Foxp3基因與IL-17、IL-6呈負相關，Foxp3基因與TGF-β呈正相關，說明Foxp3基因可能通過作用于IL-17、IL-6、TGF-β細胞調節URSA患者免疫抑制性。提示Foxp3基因的直接或間接調節可能是由于Th17/Treg細胞免疫功能障礙的作用，進而影響URSA患者的Th17/Treg細胞平衡。Th1/Th2型細胞失衡與妊娠狀態密切相關，正常妊娠狀態時母體趨向于Th2型細胞因子參與細胞免疫應答，而病理性妊娠狀態時母體趨向于Th1細胞因子參與細胞免疫應答，母體Th1型細胞因子過度表達可促進自然流產的發生，Th1型細胞因子主要為IL-2、IFNα、IFN-γ，其中IL-2可增強T細胞殺傷活性并可誘導T細胞分泌IFN-α、IFN-γ等，IFN-γ還可抑制人絨毛膜外滋養層細胞的侵入從而導致胚胎著床失敗[14]。Th2型細胞因子主要包括IL-4、IL-10，IL-4可影響自然殺傷細胞的應答及淋巴因子的殺傷活性，IL-10屬于抗炎抑制并可參與參與機體免疫反應及炎癥反應，Th2型細胞因子可抑制Th1型細胞因子的表達，研究表明Th2型細胞因子在維持正常妊娠過程中發揮重要調控作用[15]。本研究結果顯示研究組患者外周血中IL-2、IFN-α、IFN-γ水平顯著升高，IL-4、IL-10水平顯著降低，說明妊娠刺激母體免疫系統后促使免疫系統分泌異常從而促進URSA的發生。本研究進一步分析顯示Foxp3基因與IL-2、IFN-α、IFN-γ呈負相關，Foxp3基因與IL-4、IL-10呈正相關，提示Foxp3基因表達量降低可能通過引起免疫平衡失調而增加危險因子及減少保護因子從而促進URSA的發生及發展。相關報道指出PD-1、Tim-3屬于T細胞負性調節因子，并可負性調節T細胞反應，Tim-3可抑制巨噬細胞活化而參與早期免疫反應，阻斷Tim-3表達可降低PD-1基因表達，進一步研究顯示PD-1、Tim-3在URSA患者外周血中表達量降低，并可能通過調節細胞免疫及體液免疫從而促進URSA的發生[16-19]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示研究組患者外周血中PD-1、Tim-3的表達水平顯著降低，進一步分析顯示Foxp3基因與PD-1、Tim-3呈正相關，提示Foxp3基因表達量降低可能通過抑制PD-1、Tim-3表達而調控細胞免疫及體液免疫從而促進URSA的發生及發展。

綜上所述，URSA患者外周血中Foxp3基因表達量降低，其表達量與Th17/Treg細胞因子、Th1/Th2型細胞因子、PD-1、Tim-3密切相關，推測Foxp3基因可能通過調節細胞免疫及體液免疫而參與URSA的發生及發展過程，可為URSA的免疫治療提供理論依據。但Foxp3基因在URSA的發生及發展過程中的作用機制尚未闡明，本研究將進一步探究Foxp3基因對URSA患者外周血單核細胞功能的影響，以期從免疫反應的啟動階段給予干預進而促使免疫反應向有利的方向發展。