血清miRNA-155聯合IL-6水平檢測對肝細胞肝癌患者預后的評估價值

陳院朝，齊惠麗，蘆晗，王升

（濮陽市安陽地區醫院檢驗科，河南 安陽 455000）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種具有惡性程度高、進展迅速和預后差等特點的全球性疾病，其發病率和死亡率分別居惡性腫瘤的前五位[1]。根治性切除手術是目前肝癌患者主要的治療手段，可達到緩解臨床癥狀、延長生存期和改善生活質量的目的[2]，但HCC術后的復發率較高，術后5年內復發率可高達60%以上，患者往往預后較差。因此，早期采取有效方法評估HCC患者術后預后情況對于及早制定干預方案并提高患者生存率具有重要的臨床意義。微小核糖核酸-155（microRNA-155,miRNA-155）是一種生物活性RNA分子，可在不同疾病人群的血清中呈特異性和穩定表達[3]，已被發現與食管鱗狀細胞癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生、發展和轉移具有緊密聯系，但其在HCC患者中的臨床應用價值尚不明確；白介素-6（Interleukin-6,IL-6）是公認的一種炎癥因子，其高水平可反映HCC患者機體的炎癥微環境狀態，與HCC的病情進展和生存期有關[4]。目前，對于miRNA-155與肝癌患者的主要集中于檢測癌組織中的miRNA-155表達，且對于聯合檢測血清miRNA-155和IL-6水平評估HCC患者預后的應用價值尚不清楚，基于此，本研究旨在探討血清miRNA-155和IL-6在HCC患者血清中的表達水平，及二者聯合檢測對預后的評估價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性選取2016年10月-2017年12月期間于我院收治的88例HCC患者作為研究對象，對其臨床資料和血清標本進行回顧性分析。88例患者中男性56例，女性32例，年齡36～83歲，平均年齡59.15±18.29歲；病理證實Edmondson分級：I級19例；II級25例；III級24例；IV級20例。納入標準：⑴結合影像學檢查、實驗室檢測等，所有患者均符合2011年《原發性肝癌診療規范》HCC相關診斷標準[5]；⑵均行根治性切除術治療，并保存有血清標本者；⑶術前未接受放、化療或射頻消融術等抗腫瘤治療者；⑷均完成2年隨訪，且具備完整的臨床及隨訪資料者。排除標準：⑴嚴重凝血功能障礙、腎功能異常及嚴重感染者；⑵合并其他惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病者；⑶全身免疫性疾病者；⑷精神異常、認知障礙患者。本研究在獲得醫院倫理委員會審核批準后實施，研究內容設計符合《世界赫爾辛基宣言》。所有患者血清標本均取自患者的外周血，并經2000r/min離心后取上清液置于液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 隨訪方案 隨訪從患者根治性切除手術后首日開始，采用門診隨訪以及電話隨訪的方式對入組患者進行追蹤，門診復查內容為CT或MRI，以及血清甲胎蛋白檢查，并詳細記錄患者隨訪期間腫瘤的復發、轉移情況，隨訪至患者死亡日期或術后2年為止。

1.2.2 分組方法 以患者隨訪兩年內出現的復發及轉移情況表示為預后不良，腫瘤復發指經影像學檢查發現患者肝內重復出現肝癌特點的結節或出現非原發性肝癌影響因素之外引起的AFP異常升高（>400ng/ml）[6]；轉移指臨床及影像學檢查顯示有淋巴結或遠處器官轉移，復發及轉移病灶均經病理檢查進行診斷確診[7]。將所有入組患者按照隨訪期間有無復發轉移分為兩組：有局部復發或遠處轉移的預后不良組和無局部復發及遠處轉移的預后良好組。

1.2.3 血清miRNA-155、IL-6檢測 取兩組患者凍存的血清標本，經解凍后采用日立7100型全自動生化分析儀檢測IL-6水平，測定方法為酶聯免疫吸附法，試劑盒購自美國BD公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書上執行；并采用實時定量-PCR方法進行血清miRNA-155的檢測，采用RNeasy Mini Kit總RNA提取試劑盒（購自美國Life Technology公司）按規定步驟提取血清中游離總RNA，即刻逆轉錄成cDNA用于擴增。選RUN6為內參照，其中miRNA-155引物序列：5'-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3'。依據設計的循環參數進行PCR擴增，擴增設置反應條件：預變性95℃、5 min；95℃、10 s變性，60℃、20 s退火，72℃、20 s延伸，經過35個循環擴增后，根據Ct值分析出miRNA相對表達量，繪制熔解曲線，根據熔解曲線判斷PCR產物的特異度。使用2-ΔΔCT法計算HCC患者血清miRNA-155的相對表達量，ΔCT=CT目標-CT內參。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0軟件對實驗數據進行分析，本研究中涉及的計數資料用%表示，采用χ2檢驗；計量資料采用“Mean±SD”表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多因素分析采用Logistic回歸模型；通過ROC曲線分析miRNA-155對HCC患者預后的預測價值；對各變量間的關系采用Pearson相關性分析，r值確定正、負相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者預后情況 在88例HCC患者中有46例患者出現復發轉移，復發轉移率為52.27%，為預后不良組；42例（47.73%）未出現復發轉移，為預后良好組。預后不良組中出現腫瘤復發38例，淋巴結轉移4例，肝內轉移2例，肺轉移2例。

2.2 不同預后患者的血清miRNA-155、IL-6表達水平及兩指標相關性 經檢測后，預后不良組患者血清中miRNA-155相對表達量和IL-6水平均明顯高于預后良好組（P＜0.05），見表1。相關性分析結果顯示，miRNA-155與IL-6的表達呈明顯正相關性（r=0.531，P=0.024）。

表1 不同預后患者血清miRNA-155、IL-6表達水平比較

2.3 影響HCC患者預后不良的單因素分析 單因素分析結果顯示，兩組在年齡、性別、腫瘤數量、乙肝表面抗原及術后介入治療次數方面比較無明顯差異（P＞0.05），兩組在腫瘤大小、病理分級、血管侵犯、血清miRNA-155表達和血清IL-6水平方面存在明顯差異（P＜0.05），見表2。

表2 影響HCC患者預后不良的單因素分析

2.2 影響HCC患者預后不良的多因素Logisitic回歸分析 以HCC患者術后是否出現預后不良作為因變量，將單因素中差異存在統計學意義的因素（腫瘤大小、病理分級、血管侵犯、血清miRNA-155表達和血清IL-6水平）作為自變量，并進行賦值，腫瘤大小（<5.0cm=0，≥5.0cm=1）、病理分級（I級～II級=0，III級～IV級=1）、血管侵犯（無=0，有=1）、血清miRNA-155表達（<1.0=0，≥1.0=1）、血清IL-6水平（<2.2=0，≥2.2=1），并將其納入Logisitic回歸模型中，結果顯示有血管侵犯、血清miRNA-155表達≥1.0和血清IL-6水平≥2.2 μg/L是HCC患者出現預后不良的獨立預測因素，見表3。

表3 影響HCC患者預后不良的多因素Logisitic回歸分析

2.3 單項指標預測與聯合預測HCC患者預后不良的ROC曲線分析ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-155、IL-6表達量聯合預測HCC患者預后不良的ROC曲線下面積0.865明顯高于兩項指標單獨預測的ROC曲線下面積0.787和0.770（P＜0.05）；且血清miRNA-155、IL-6表達量預測HCC患者預后不良時的閾值分別為1.048、2.322μg/L，見圖1，表4。

表4 血清miRNA-155、IL-6表達量預測患者預后的ROC曲線下面積

圖1 血清miRNA-155、IL-6表達量單獨預測與聯合預測HCC預后的ROC曲線

3 討論

微小核糖核酸是機體代謝分子群中新近發現的生物活性RNA分子，能在血清和血漿中持續且穩定的表達，可通過調控細胞的增殖、分化和凋亡發揮抑癌或促癌作用，與多種惡性腫瘤及疾病的發生、發展及預后密切相關[8]。其中miRNA-155是與機體免疫平衡、炎癥反應有關的一種促癌基因，已被報道可作為多種癌癥和疾病預后的分子標志物[9]。何榮琦等[10]非小細胞肺癌患者癌組織中呈高表達，與癌癥的惡性進展和不良預后密切相關，可作為潛在預后評估的標記物；張超等[11]研究發現，miRNA-155在乳腺癌患者血清表達水平比正常人群的要高，且miRNA-155高表達患者術后生存率較低，預后較差。然而目前關于miRNA-155聯合IL-6檢測在HCC患者預后評估中的應用價值尚不明確，本研究對HCC患者血清miRNA-155、IL-6進行檢測，探討二者對HCC預后的預測價值對于臨床上指導HCC患者術后及早干預具有重要作用。

本研究通過血清檢測發現，預后不良組患者血清中miRNA-155相對表達量和IL-6水平均明顯高于預后良好組，可見miRNA-155、IL-6在HCC預后不良患者血清中呈較高表達。經隨訪2年，HCC患者出現預后不良的單因素分析結果顯示，兩組在腫瘤大小、病理分級、血管侵犯、血清miRNA-155表達和血清IL-6水平方面存在明顯差異，提示HCC患者術后出現復發或轉移可能與以上因素具有一定的聯系。進一步的多因素分析結果顯示，有血管侵犯、血清miRNA-155表達≥1.0和血清IL-6水平≥2.2 μg/L是HCC患者出現預后不良的獨立預測因素。血管侵犯已被研究證實是HCC術后預后不良的主要危險因素之一，可通過肝內轉移進一步導致腫瘤復發,降低患者術后生存率[12,13]。同時可以看出，miRNA-155、IL-6在患者血清中的高表達與HCC術后出現不良預后具有重要聯系。HCC的發生與機體的長期炎癥反應和微環境密切相關,腫瘤的發展過程中炎癥反應發揮了決定性作用。miRNA-155是一種已被認為具有癌基因特性的miRNA分子，在多種惡性腫瘤疾病中呈異常高表達[14]。miRNA-155過表達對HCC患者預后的影響機制可能在于：⑴miRNA-155參與T細胞、B細胞和巨噬細胞的發育、分化、活化、增殖及其穩態的維持[15],可通過上調腫瘤壞死因子-α水平，進一步對輔助性T細胞的增殖以及T細胞亞群比例進行調節，導致患者體內免疫應答失衡，加劇炎癥反應，有利于癌細胞的增殖和擴散，最終引起腫瘤復發或轉移。⑵miRNA-155可能通過對抑癌基因caspase-3活性的抑制，進一步抑制HCC腫瘤細胞凋亡；并且miRNA-155的高表達能夠降低TP53INPI的表達，抑制細胞周期捕獲，減少癌細胞凋亡[16]。IL-6是一種由Kupffer細胞釋放的炎癥介質，其在血清中水平升高可促進肝癌多個階段的進展，與HCC的發生、發展具有重要聯系。研究表明[17]，IL-6水平升高是人類病毒性肝炎向肝癌快速進展的有效預測指標之一。IL-6在HCC患者根治性手術前血清中的表達上升可反映出腫瘤的局部炎癥反應嚴重,可能存在腫瘤炎性浸潤導致腫瘤突破包膜并蔓延至包膜外側,腫瘤目前已經處于擴展期，導致進展期肝癌患者術后的不良預后[18]。由此可見，miRNA-155與IL-6的高表達均與HCC的不良預后有關，二者存在著正相關關系，miRNA-155可能通過調控免疫應答系統進一步調節IL-6水平，共同參與HCC的術后進展。因此，可見血清miRNA-155與IL-6的較高表達均會增加HCC患者術后復發或轉移的風險，導致預后不良。本研究ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-155、IL-6表達量聯合預測HCC患者預后不良的ROC曲線下面積明顯高于兩項指標單獨預測的ROC曲線下面積，表明血清miRNA-155聯合IL-6水平檢測對于HCC患者預后的評估價值更高，可能作為評估HCC患者不良預后的新指標。臨床上可在術前聯合檢測二者指標水平,評估患者預后的情況，及早制定術后干預措施，以改善患者預后。

綜上所述,血清miRNA-155、IL-6水平在HCC預后不良患者血清中呈較高表達，二者聯合檢測對于HCC患者預后具有較好的評估價值，可能作為臨床上評估HCC患者不良預后的分子標志物。