TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA在宮頸病變中的診斷價值及與臨床病理因素的相關性

趙慧敏，李炳琪

（1.鄭州卷煙廠康復醫院婦科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬醫院婦產科，河南 鄭州 450000）

宮頸癌為15歲及以上女性病死首要原因之一，具有發病率高、病死率高等特征[1]。流行病學監測數據顯示，發展中國家宮頸癌每年新發病例占全球患病人數的90%左右，嚴重威脅女性健康[2]。國內外眾多科學實驗及統計資料均指向人乳頭狀瘤病毒（HPV）長期作用是誘發宮頸癌的主要危險因素，同時HPV DNA、脫落細胞聯合診斷是臨床早期發現宮頸癌的重要手段[3,4]。但宮頸癌病變是一個長期過程，尤其是HPV在女性中有較高攜帶率、感染率，但大部分可自行清除，HPV DNA檢測缺乏特異性。近年隨研究深入發現，炎性微環境在多種腫瘤進展、血管新生、侵襲中發揮重要作用，而上述生物學過程主要由包括腫瘤壞死因子（TNF）在內的諸多炎癥細胞因子、生長因子實現調控過程[5,6]。腫瘤壞死因子受體-1(TNFR1)mRNA異常表達可反映TNF活性狀態，二者結合效應可影響腫瘤增殖、轉移、血管形成等多個環節。T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1（Tiam1）是一種原癌基因，其已被臨床證實在不同類型細胞形態轉化、運動、等過程中發揮重要作用[7]。基于上述研究，本研究嘗試分析TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量與宮頸病變臨床病理因素的相關性，旨在為臨床防治宮頸癌、完善預警機制提供更多選擇。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2014年1月-2016年6月收治的宮頸病變患者162例作為研究對象。年齡26～63歲，平均44.41±6.33歲。取162例患者宮頸病變組織進行病理學檢測，判斷細胞分級、組織類型、淋巴結轉移、肌層浸潤情況。宮頸癌患者42例，宮頸上皮內瘤病變（CIN）患者58例，子宮肌瘤患者62例。納入標準：原發性宮頸病變；均行手術治療，經病理學診斷確診宮頸病變情況，且為首次確診；入組前未經生物制劑、放化療、中藥制劑治療。排除標準：繼發性宮頸病變者；患者既往因陰道或宮頸病變接受激光、藥物或冷凍治療者；血人絨毛膜促性腺激素(HCG)檢測確認當前妊娠狀態者；臨床資料缺失者。

1.2 方法 ⑴主要設備、試劑：美國Invitrogen總RNA提取試劑盒，日本Takara逆轉錄、PCR試劑盒，Tiam1、TNFR1與內參引物均由安迪生物科技上海有限公司設計完成，SP免疫組織化學試劑盒、PBS、DAB試劑均為上海西塘生物科技有效公司提供，兔抗人Tiam1、TNFR1多克隆抗體購自北京奧維亞生物技術有限公司，實時熒光定量PCR系統購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，光學顯微鏡購自日本基恩士。⑵檢測方法：取不同子宮頸組織，研磨，加細胞裂解液，以總RNA提取試劑盒提取總RNA,紫外分光光度計測所提取總RNA純度,A260/A280≥1.8為合格。逆轉錄總RNA為單鏈模板cDNA，采取PCR試劑盒實施擴增。引物序列：Tiam1引物，上游5′-CAGGACTCCACGGGGCCTCA-3′；下游5′-AGTGCTCCTCGCTCTCCGCA-3′；β-actin引物，上游5′-CGGGGTCACCCACACTGTGC-3′；下游5′-GGGCAGCGGAACCGCTCATT-3′。PCR反 應 條 件94℃30s，92℃30s，56℃30s，72℃30s，連續36個循環，設置平行反應復孔3個/樣品。TNFR1引物，正向引物5′-CTAGACACTGATGACcCCGC-3′；反向引物5′-GAATTCCTTCCAG CGCAACG-3′。PCR反 應 條 件50℃2min，95℃10min，95℃15s，30℃30s，共40個循環。均采取2-△△Ct法 獲 取 組 織 內Tiam1、TNFR1基 因 相 對 表 達量。

1.3 觀察指標 ⑴不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量。⑵不同臨床病理特征宮頸癌患者TNFR1 mRNA表達量。⑶不同臨床病理特征宮頸癌患者Tiam1 mRNA表達量。⑷TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量與病理特征相關性。⑸生存分析。

1.4 統計學處理采用SPSS22.0統計分析軟件，相關性采取Pearson相關性系數分析；符合正態分布的計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；Kaplan-Meier曲線進行生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量隨宮頸病變嚴重程度增加呈升高趨勢（P＜0.05），見表1。

表1 不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量比較()

表1 不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量比較()

疾病類型 例數宮頸癌患者CIN患者子宮肌瘤患者F值P值42 58 62 TNFR1 mRNA 2.25±0.38 0.91±0.20 0.40±0.13 756.027＜0.001 Tiam1 mRNA 2.08±0.16 1.71±0.14 1.29±0.11 438.046＜0.001

2.2 不同臨床病理特征宮頸癌患者TNFR1 mRNA表達量 不同年齡、病理類型宮頸癌患者TNFR1 mRNAmRNA表達量無明顯差異（P＞0.05）；不同TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、浸潤深度、分化程度患者TNFR1 mRNA表達量相比，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同臨床病理特征宮頸癌患者TNFR1 mRNA表達量比較()

表2 不同臨床病理特征宮頸癌患者TNFR1 mRNA表達量比較()

臨床病理特征 例數年齡（歲）≤45＞45腫瘤大小（cm）≤4＞4病理類型鱗癌腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結轉移TNFR1 mRNA t/F值P值0.528 0.600 25 17 2.23±0.28 2.28±0.33 10.288＜0.001 22 20 1.80±0.23 2.75±0.36 0.669 0.507 27 15 2.23±0.26 2.29±0.31 8.007＜0.001 24 18 1.96±0.25 2.64±0.30 7.354＜0.001否是30 12 2.04±0.28 2.78±0.33浸潤深度＜1/2≥1/2分化程度高分化中分化低分化11.171＜0.001 22 20 1.81±0.22 2.73±0.31 12.233＜0.001 12 20 10 2.01±0.20 2.24±0.24 2.56±0.35

2.3 不同臨床病理特征宮頸癌患者Tiam1 mRNA表達量 不同年齡、病理類型宮頸癌患者Tiam1 mRNA表達量無明顯差異（P＞0.05）；不同TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、浸潤深度、分化程度患者Tiam1 mRNA表達量相比，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同臨床病理特征宮頸癌患者Tiam1 mRNA表達量比較()

表3 不同臨床病理特征宮頸癌患者Tiam1 mRNA表達量比較()

臨床病理特征 例數年齡（歲）≤45＞45腫瘤大小（cm）≤4＞4病理類型鱗癌腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結轉移Tiam1 mRNA t/F值P值0.876 0.387 25 17 2.05±0.16 2.10±0.21 2.520 0.016 22 20 2.02±0.13 2.15±0.20 0.526 0.602 27 15 2.07±0.17 2.10±0.19 6.766＜0.001 24 18 1.92±0.12 2.29±0.23 6.444＜0.001否是30 12 1.97±0.14 2.36±0.25浸潤深度＜1/2≥1/2分化程度高分化中分化低分化6.214＜0.001 22 20 1.90±0.15 2.28±0.24 14.480＜0.001 12 20 10 1.92±0.13 2.07±0.15 2.29±0.21

2.4 TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量與病理特征相關性Pearson相關性分析，TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度呈正相關，與分化程度呈負相關（P＜0.05），見表4。

表4 TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表達量與病理特征相關性

2.5 生存分析 隨訪36個月，根據ROC曲線最佳截斷值分高表達患者、低表達患者，KM曲線分析顯示，高表達患者、低表達患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA生存曲線對比，差異有統計學意義（χ21=5.075，P1=0.024；χ22=5.125，P2=0.024），見圖1-2。

圖1 生存曲線（TNFR1 mRNA）

3 討論

近年隨癌癥患病人數逐年升高,其已發展成困擾人類健康、導致死亡的主要病因，在全世界無論發達國家或發展、落后國家，癌癥已成為一個巨大的社會經濟負擔[8,9]。宮頸癌細胞遷移、侵襲能力較強，臨床數據顯示，手術時存在盆腔淋巴結轉移者術后復發率高達80%[10]。因此，從分子層面探究影響宮頸癌細胞遷移、侵襲相關機制，對早期診斷、提供基因治療靶位具有重要意義。

圖2 生存曲線（Tiam1 mRNA）

Tiam1是一種重要促惡性細胞轉移基因，參與介導二磷酸鳥嘌呤核苷酸及三磷酸鳥嘌呤核苷酸轉換、Ras超家族催化等生物學過程，基礎研究顯示，Tiam1與骨架結構重構、細胞形態轉化、遷移、侵襲、運動等過程關系密切[11]。本研究結果顯示，隨宮頸病變嚴重程度增加Tiam1 mRNA表達量呈升高趨勢（P＜0.05），與學者汪俊等[12]研究結果近似。學者張源等[13]研究指出，Tiam1蛋白表達與胃腺癌臨床分期、分化程度、漿膜浸潤、淋巴結轉移等病理因素關系密切。本研究也顯示，不同TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、浸潤深度、分化程度宮頸癌患者Tiam1 mRNA表達量存在顯著差異（P＜0.05），進一步推測，Tiam1在腫瘤侵襲、轉移中發揮重要作用，可能參與腫瘤進展過程。分析Tiam1 mRNA異常轉錄致Tiam1過表達可激活RAC1癌基因，參與并調控惡性細胞黏附、運動、細胞凋亡等過程，促進正常細胞惡性轉化。本研究也發現Tiam1 mRNA表達量與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度呈正相關。此外，國外有學者指出，Tiam1與惡性病變患者預后關系密切，其過表達是漿液性卵巢癌患者預后不良的獨立危險因素[14]。本研究KM生存分析顯示，隨訪36個月高表達患者生存率51.80%顯著低于低表達患者91.50%，說明Tiam1 mRNA表達與宮頸癌患者預后關系密切。

TNF因其炎癥介質特性，在慢性炎癥疾病中已被證實參與惡性腫瘤發生、發展、轉移過程。學者Wang H等[15]等所提供研究證據顯示，TNF缺陷小鼠能抑制12-0-十四酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）所介導的皮膚癌變。病理實驗證實，無論在癌變早期階段，或是進展、轉移階段，TNF均可與其受體TNFR1結合參與新生血管生成、基質破壞等生物學過程，發揮促腫瘤效應[16]。本研究對不同病理階段宮頸組織TNFR1 mRNA實驗數據分析，宮頸病變患者隨病情加重TNFR1 mRNA表達呈升高趨勢，且其表達與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度呈正相關，與分化程度呈負相關（P＜0.05）。學者Zhang T等[17]也研究發現，宮頸癌患者外周血存在TNFR1高表達，說明發生宮頸癌時，機體免疫監視系統激活，刺激單核巨噬細胞大量分泌TNF，惡性細胞表面TNFR1相應增加，共同參與調控宮頸癌免疫網絡。本研究高表達患者、低表達患者TNFR1 mRNA生存曲線間存在顯著差異（P＜0.05），宮頸組織中TNFR1 mRNA高表達預示預后不良，可作為預后評估指標。

綜上可知，宮頸病變組織中存在TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA異常表達情況，且與分期、腫瘤大小等臨床病理因素關系密切，聯合檢測可為臨床診斷、預后評估提供理論依據。