SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB或FQ-PCR在痰涂片陰性肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

周曉慶，李斐，楊淑芳

（義馬煤業(yè)集團股份有限公司總醫(yī)院檢驗科，河南 三門峽 472300）

目前臨床上針對肺結(jié)核，采用痰涂片法、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法等常規(guī)方法診斷。但經(jīng)實踐發(fā)現(xiàn)，痰涂片法的陽性率不高，極易出現(xiàn)誤診、漏診等事件；而結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法具有較高的檢出率，但因耗時長，無法實現(xiàn)快速篩查的目標，并且容易延誤病情，增加結(jié)核病播散風險[1]。基于此，尋求一種特異性高、敏感性高、準確性高，且能夠快速診斷的檢測方法顯得尤為重要，也是臨床一直研究的重要課題。隨著醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)檢測技術(shù)已成為診斷傳染性疾病的重要方法，譬如結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時熒光檢測（SAT-TB）、結(jié)核T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）、熒光定量PCR（FQ-PCR）等[2,3]。有學(xué)者研究表示，SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB或FQ-PCR檢測方法比單獨使用更有利于提高陽性檢出率，但臨床關(guān)于以上檢測方法聯(lián)合應(yīng)用的研究報道較少，尚不清楚聯(lián)合使用后，其特異性、敏感度及準確率是否能得到顯著提高。故本次選取158例痰涂片陰性疑似肺結(jié)核患者的臨床資料進行回顧性分析，旨在探討SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB或FQ-PCR的診斷價值。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年3月-2020年3月診治的158例痰涂片陰性疑似肺結(jié)核患者的臨床資料。經(jīng)臨床確診為肺結(jié)核共52例、非肺結(jié)核共106例。診斷標準：符合“肺結(jié)核診斷和治療指南(2001年訂)”中的診斷標準；納入標準：⑴經(jīng)相關(guān)檢查表明存在與活動性肺結(jié)核相符的病變；⑵無其他肺部疾病；⑶無惡性腫瘤等疾病。排除標準：⑴臨床資料不全；⑵合并精神類疾病；⑶合并肺癌等疾病。158例受檢人員中男性共82例、女性共76例；年齡范圍35～72歲，年齡平均值51.45±1.45歲。

1.2 方法 回顧性分析本次所有受檢人員行SATTB、T-SPOT.TB、FQ-PCR檢測的臨床資料。其步驟如下。

1.2.1 標本處理 先為受檢人員行氣管表面麻醉，置入纖維支氣管鏡探測支氣管肺段情況，采用質(zhì)量濃度為9g/L的NaCl注射液15mg灌洗胸部，經(jīng)X線平片顯示病灶部位，再采用負壓吸引器回收灌洗液10ml，置于無菌瓶中；隨后在回收灌洗液加入質(zhì)量濃度為40g/L的NaCl注射液，待其液化后取1ml置于試管中，離心5min，棄上清液后再次離心，取部分下層沉渣，采用裂解液50μl行重懸，超聲破損15min，取2μl制成涂片。

1.2.2 SAT-TB檢測方法 采用上海仁度生物科技有限公司提供的TB核酸檢測試劑盒，操作方法按照說明書進行。其中，以樣本曲線和閾值曲線產(chǎn)生的交叉點為橫坐標讀數(shù)，即DT,當DT小于或等于35min表示為陽性，當DT大于40min則表示為陰性，若DT大于35min，但小于或等于40min，則需重新檢測。

1.2.3 T-SPOT.TB檢測方法 采用上海復(fù)星醫(yī)藥科技有限公司提供的結(jié)核感染T細胞斑點診斷試劑盒，當ESAT-6或CFP-10任一檢測孔達到以下標準則判斷其為陽性：⑴空白對照孔斑點數(shù)目小于或等于5個,檢測孔斑點數(shù)目減少空白對照孔斑點數(shù)目后仍大于或等于6個；⑵空白對照孔斑點數(shù)目大于或等于6個,檢測孔斑點數(shù)目是空白對照孔斑點數(shù)目的2倍。

1.2.4 FQ-PCR檢測方法 采用平臺PCR儀性熒光探針法檢測從痰標本中提取的DNA及RNA，試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供。按照說明書進行操作。

1.3 觀察指標

1.3.1 觀察SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR、SATTB聯(lián)合T-SPOT.TB、SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR方法檢測肺結(jié)核的陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。

1.3.2 分析上述五種方法準確率、誤診率、漏診率。

1.3.3 評估上述五種方法診斷肺結(jié)核的AUC值、敏感度、特異度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件分析本次數(shù)據(jù)。計量資料用（）表示，行獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用（n；%）表示，行χ2檢驗；診斷價值采用ROC曲線分析；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測方法的陽、陰預(yù)測值比較158例痰涂片陰性疑似肺結(jié)核患者經(jīng)SAT-TB檢測后陽性預(yù)測值為68.25%，陰性預(yù)測值為90.53%；經(jīng)經(jīng)TSPOT.TB檢查后陽性預(yù)測值為68.97%，陰性預(yù)測值為88.00%；經(jīng)FQ-PCR檢查后陽性預(yù)測值為61.02%，陰性預(yù)測值為83.84%；均低于金標準（P＜0.05）。見表1。

表1 SAT-TB與金標準的陽、陰性率比較

2.2 聯(lián)合檢測的陽、陰性預(yù)測值比較158例痰涂片陰性疑似肺結(jié)核患者經(jīng)SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB檢測后陽性預(yù)測值為96.15%，陰性預(yù)測值為98.11%；經(jīng)SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR檢查后陽性預(yù)測值為85.45%，陰性預(yù)測值為95.14%；兩種方法比較，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB與金標準的陽、陰性率比較

2.3 準確率、誤診率、漏診率比較SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB、SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR的準確率高于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR單獨檢測，而誤診率、漏診率低于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR單獨檢測（P＜0.05）；SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB的準確率高于SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR（P＜0.05）;但誤診率、漏診率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 五種檢查方法的敏感性、特異性、準確率、誤診率、漏診率比較

2.4 ROC曲 線 分 析SAT-TB、SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR、SAT-TB聯(lián) 合T-SPOT.TB、SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR診斷肺結(jié)核的AUC值分別為（0.819、0.800、0.738、0.971、0.914，P＜0.05）；敏感度分別為82.70%、76.90%、69.20%、96.20%、90.40%；特異度分別為81.10%、83.00%、78.30%、98.10%、92.50%。見表4。

表4 五種方法的曲線下面積AUC值

3 討論

圖1 五種方法的ROC曲線分析

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查[4]發(fā)現(xiàn)，我國是肺結(jié)核病的高發(fā)國家，目前在世界位居第三。但因肺結(jié)核患者的臨床癥狀復(fù)雜多樣及影像學(xué)改變有時無特異性，導(dǎo)致其發(fā)現(xiàn)率在臨床上一直不高，尤其是痰涂片對肺結(jié)核的診斷，一直是困擾臨床醫(yī)師的難題[5,6]。痰培養(yǎng)是臨床診斷肺結(jié)核的金標準，雖然改良后的Bactec快速結(jié)核菌培養(yǎng)系統(tǒng)比傳統(tǒng)的培養(yǎng)時間更短，但離臨床對肺結(jié)核病的快速診斷要求仍有一定距離。FQ-PCR是在常規(guī)PCR擴增的基礎(chǔ)上，采用熒光標記探針進行定量檢測，且通過結(jié)合雜交與廣譜技術(shù)進行定量分析，其目的在于提高檢出率。但進一步分析發(fā)現(xiàn)，因其檢測的靶標為DNA，故無法區(qū)分病變活性及感染進程，且在交叉感染時，會對檢測結(jié)果造成一定影響[7]。而T-SPOT.TB檢測方法因需時短、特異性高等特點，得到廣泛開展，但也存在不足之處，同樣無法區(qū)分活動性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，另外，也不能預(yù)測結(jié)核分枝桿菌潛伏感染是否存在發(fā)展為活動性結(jié)核病的風險，故此在臨床上受到一定限制[8-10]。

SAT-TB為核酸檢測技術(shù)，通過檢測結(jié)核分枝桿菌特異的16s rRNA,再根據(jù)擴增靶標判斷標本是否存在結(jié)核分枝桿菌,與上述兩種不同,因以RNA為檢測靶標,所以在檢測過程中能準確區(qū)分病菌的活性，并且不易被污染。但經(jīng)實踐發(fā)現(xiàn)，也存在不足之處，既檢測過程中易造成假陰性結(jié)果。本文基于假陰性結(jié)果的考慮,建議與T-SPOT.TB或FQ-PCR聯(lián)合檢測,以此提高準確診斷率[11,12]。研究結(jié)果顯示，SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB、SAT-TB聯(lián)合FQ-PCR的準確率高于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR單獨檢測，但兩種聯(lián)合方法相比，SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB的準確率更高，且ROC曲線分析中可見，SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB的AUC值高達0.971，提示其具有較高的預(yù)測價值。可能與提高病菌活性與分枝桿菌種類鑒別力度有關(guān),從而為臨床判斷疑似肺結(jié)核提供客觀依據(jù)。其中，SAT-TB、FQ-PCR檢測方法與痰涂片不同，是通過收集受檢人員的肺泡灌洗液，再制成涂片，實施快速診斷，對于無痰受檢人員而言,肺泡灌洗液的收集能使檢測技術(shù)更具有時效性、簡便性及準確性。另外,與臨床常用的涂片熒光染色相比,其檢測時間更短,可從1d以上縮短至1.5h，有利于實現(xiàn)快速有效診斷的目標[13-16]。此外,SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB、SATTB聯(lián)合FQ-PCR的誤診率、漏診率低于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR單獨檢測,提示聯(lián)合檢測有利于提高診斷確診率,但在兩種聯(lián)合檢測方法比較中，發(fā)現(xiàn)SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB檢測的誤診率、漏診率更低。其中，SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB檢測出現(xiàn)2例假陽性與2例假陰性，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其原因與肺泡液收集時支氣管鏡消毒不嚴格或標本運輸過程中受到污染等因素具有一定相關(guān)性。基于此，在操作過程中應(yīng)加強關(guān)注，且通過采取有效的應(yīng)對措施，避免對診斷結(jié)果造成不良影響。

綜上所述，SAT-TB聯(lián)合T-SPOT.TB或FQPCR在痰涂片陰性肺結(jié)核中具有較高的診斷價值，能夠減少漏診及誤診。