癲癇患者血清miR-222、BAFF水平表達的臨床意義及對預后的影響

劉震宇，姚淑芳

（河南省三門峽市中心醫院神經內科，河南 三門峽 472000）

癲癇常規治療方式包括藥物治療、手術治療等,成人癲癇一般通過藥物治療可以得到有效控制,但是，部分患者在治療后預后不佳，癲癇發作仍較為頻繁[1]。若能早期預測癲癇患者的預后情況，對調整治療方案，改善患者預后較為重要。癲癇的發生發展與機體的免疫功能有關，研究表明，炎癥反應和免疫功能紊亂均會增加癲癇的發生風險，加重癲癇病情,且多種免疫相關因子在癲癇患者中表達異常[2]。白細胞介素（interleukin，IL）-10、B細胞活化因子(B-cell activating factor of TNF family,BAFF)是常見的炎癥因子，其異常表達與免疫功能紊亂有關,研究證實，IL-10、BAFF與癲癇病情關系密切[3]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)可能是癲癇發病的關鍵因素之一，在癲癇、中樞神經系統異常病變等疾病的發生發展中具有促進或抑制作用，且已有研究從miRNA靶基因和途徑出發探索癲癇治療方法[4]。miR-222可調節炎癥因子，刺激炎癥因子、黏附因子的分泌，加重免疫功能紊亂,增加疾病發生風險,而且可能和炎癥因子相互作用促進癲癇的發生[5]。由此推測，miR-222、BAFF可能與癲癇患者的預后有關。基于此，本研究分析癲癇患者血清miR-222、BAFF水平表達的臨床意義及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻選擇2017年1月-2018年1月醫院113例癲癇患者作為研究對象。本研究經我院醫學倫理委員會審核通過,患者與家屬均知情且自愿簽署同意書。其中，男68例，女45例；年齡32～73歲,中位年齡49.00（45.00,53.00）歲；體重指數18.23～25.97kg/m2,中位體重指數22.03（21.63,22.41）kg/m2；病程1～12年,中位病程3.00（2.00，3.00）年；治療前發作次數2～12次/月，治療前發作次數中位數6.00（5.00，6.00）次/月。⑴納入標準：①符合《臨床診療指南：癲癇病分冊》[6]癲癇診斷標準；②經腦電圖檢查確診癲癇；③顱腦損傷引起的繼發性癲癇。⑵排除標準：①基因檢測驗證為存在基因突變導致的癲癇發作；②肌陣痙攣性癲癇；③合并感染性疾病；④惡性腫瘤；⑤失訪。

1.2 方法

1.2.1 血清指標檢測方法⑴miRNA：入院時，采集5ml空腹靜脈血，靜置30min（常溫下），離心機（鄭州中谷機械設備，TGL-16）離心，-80℃下保存待測。使用上海康朗生物提供的Trizol RNA試劑盒，加入Trizol RNA，提取RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA總純度是否達標（純度良好區間范圍為1.8～2.0）,達標后使用德國QIAGEN公司提供的PCR試劑盒,加入0.5μl逆轉錄酶，于37℃下水浴，將總RNA反轉錄為cDNA,使用實時PCR系統（Applied Bioststems，7500）擴增,采用2﹣△△Ct法計算血清miR-222、miR-21相對表達量。miR-222正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACTG-3'；反向引物：5'-CTCAACTGGTCTCGTGCA-3'。miR-21正 向 引 物：5'-CTGCAGGGTCCGAGGT-3'；反 向 引 物：5'-GCCCCTAGCTTACACACTGATCT-3'。⑵炎癥因子：入院時，采集5ml空腹時靜脈血離心取上清,置于-20C冰箱保存待測，采用酶聯免疫試劑盒，以酶聯免疫吸附法檢測血清IL-10、BAFF表達。

1.2.2 治療方法 ⑴詢問病史、腦電圖檢查等明確患者8周內癲癇發作的頻次、類型和抗癲癇藥物使用情況；⑵口服左乙拉西坦（UCB Pharma S.A.公司，生產批號：20160922、20170825，規格：0.25g），初始劑量為250mg/次,2次/d，在4周內逐漸增加至500mg/次,2次/d，共維持治療12周，進入開放性治療期，繼續口服左乙拉西坦500mg/次,2次/d，繼續觀察12周。共治療24周。

1.2.3 預后評估方法 治療完成后1年,采用Engel分級[7]評估預后，Ⅰ級：僅有先兆發作或發作完全消失；Ⅱ級：發作次數≤3次/年；Ⅲ級：發作次數＞但較治療前減少≥75%；Ⅳ級：發作次數較治療前減少＜75%。Ⅰ級為預后良好，Ⅱ級-Ⅳ級為預后不良。

1.3 統計學方法 用SPSS 23.0軟件處理數據，計數資料以%和n表示，組間比較采用χ2檢驗；全部計量資料均經Shapiro-Wilk正態性檢驗，偏態分布計量資料用中位數（四分位數）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；血清指標與癲癇患者預后不良的關系采用Logistic回歸分析檢驗；繪制受試者工作曲線（ROC），并計算曲線下面積（AUC）值，檢驗血清miR-222、BAFF水平預測癲癇患者預后不良的價值，AUC值＞0.9表示預測性能較高，0.71～0.90表示有一定預測性能，0.5～0.7表示預測性能較低，＜0.5表示無預測性能，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預后結局 治療完成后經1年隨訪統計顯示，研究內113例癲癇患者中預后不良的患者有31例，占比為27.43%（31/113），其中Ⅱ級18例，Ⅲ級11例，Ⅳ級2例；預后良好的（Ⅰ級）的患者有82例，占比為72.57%（82/113）。

2.2 兩組患者基線資料比較 預后不良組miR-222、miR-21、IL-10、BAFF水 平 均 高 于 預 后 良 好組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組其他基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較

2.3 血清指標與癲癇患者預后不良關系的Logistic回歸分析 將2.2中比較結果顯示差異有統計學意義的變量納入作為自變量（均為連續變量）,將癲癇患者預后情況作為因變量（1=預后不良，0=預后良好）,經Logistic回歸分析檢驗結果顯示,miR-222、BAFF與癲癇患者預后不良有關，二者過表達可能是癲癇患者預后不良的風險因子（OR＞1，P＜0.05）。見表2。

表2 血清指標與癲癇患者預后不良關系的Logistic回歸分析

2.4 血清miR-222、BAFF單獨及聯合預測癲癇患者預后不良的價值 將癲癇患者預后情況作為狀態變量（1=預后不良，0=預后良好），將入院時血清miR-222、BAFF水平作為檢驗變量，繪制ROC曲線圖,見圖1,結果顯示,入院時血清miR-222、BAFF水平單獨及聯合預測癲癇患者預后不良的AUC分別為0.731、0.783、0.801,均有一定預測價值,且當二者的cut-off值分別取1.208、7.837ng/ml時，可獲得最佳預測價值。見表3。

圖1 血清miR-222、BAFF單獨及聯合預測癲癇患者預后不良的ROC曲線圖

表3 血清miR-222、BAFF單獨及聯合預測癲癇患者預后不良的價值

3 討論

目前,普遍認為癲癇的發病與中樞神經系統感染、腦部結構病變等因素有關，但具體發病機制尚不清楚，而且，目前癲癇治療現狀不佳[8]。因此，尋找新的生物標志物來預測癲癇患者的預后,對癲癇的治療和病情評估較為重要。

研究表明，癲癇患者治療現狀不甚理想[9]。本研究結果顯示，治療完成后經1年隨訪統計顯示，研究內113例癲癇患者中預后不良的患者有31例，占比為27.43%，其中Ⅱ級18例，Ⅲ級11例，Ⅳ級2例。說明，仍有較多癲癇患者在藥物治療后無法得到有效控制，預后情況不佳。研究表明，癲癇患者IL-10水平異常升高，IL-10水平升高與癲癇的發生有關[10]。miR-21被發現與自身免疫性疾病的發病機制相關,在調節自身免疫反應中起重要作用[11]。本次研究結果顯示，預后不良組miR-21、IL-10水平均高于預后良好組，說明miR-21、IL-10可能與癲癇患者預后不良有關。但后經Logistic回歸分析檢驗，miR-21、IL-10與癲癇患者預后不良無關,這可能是由于其他因素產生的影響造成，因此，無法將其作為癲癇患者預后不良的預測指標。

癲癇的發作與加重均與機體異常表達的凋亡分子和過度釋放的炎癥因子聯系緊密[12]。BAFF屬于腫瘤壞死因子超家族，分泌于單核細胞、樹突狀細胞等，與免疫系統功能有關，在自身免疫的發展中起著關鍵作用[13]。研究表明，BAFF可參與免疫調節,而癲癇的發生發展與免疫功能障礙有關[14]。miRNA參與了癲癇的發生發展，miRNA能調控下游基因的翻譯和轉錄，改變相關蛋白含量，激活細胞內信號，從而導致疾病的發生[15]。miR-222能節炎性因子，促進凋亡分子活化，增加炎癥因子水平[16]。本研究通過對比不同預后情況患者入院時血清BAFF、miR-222水平后經Logistic回歸分析檢驗結果顯示，miR-222、BAFF與癲癇患者預后不良有關,各指標過表達可能是癲癇患者預后不良的風險因子。分析原因可能為：BAFF水平升高增加癲癇患者預后不良的風險可能是由于BAFF對人體免疫的作用，BAFF可調節T細胞主導的免疫反應，刺激B細胞中重組蛋白的生成,從而調控T細胞存活，造成免疫功能紊亂，從而引起或加重神經系統紊亂，從而影響癲癇患者預后結局[17,18]。研究表明，BAFF對人體的免疫調節作用可以促進抑制性細胞因子分泌，如IL-35，起到一定的負向免疫調節作用,減輕機體炎癥反應程度，改善癲癇患者病情，提高預后[19]。此外，動物實驗證實，BAFF參與癲癇的發生發展[20]。作為調節因子，miR-222可受促炎因子的誘導而增加分泌，并刺激炎癥因子、黏附因子表達，加重炎癥反應[21]。miR-222對機體神經元細胞具有傷害性，會破壞神經元鞘膜，誘發或增加異常放電，從而影響癲癇的治療，對癲癇患者的預后產生負面影響[22]。

最后，本研究繪制ROC曲線圖，結果顯示，入院時血清miR-222、BAFF水平單獨及聯合預測癲癇患者預后不良的AUC分別為0.731、0.783、0.801，均有一定評估價值。未來臨床若監測到上述指標異常，應調整癲癇治療方案，增加營養神經類藥物、免疫調節類藥物治療等，以改善預后結局。但值得注意的是，miR-222、BAFF可能相互影響，共同促進癲癇病情進展，影響癲癇的治療和預后，但本文未分析兩者間的聯系，后續應增加研究繼續探索。

綜上所述，癲癇患者血清miR-222、BAFF水平表達與預后不良有關，可用于癲癇患者預后結局的預測。