新型牙科有機硅季銨鹽偶聯效果及抗菌活性的初步評價

王迎捷 方明 黃鸝 唐立輝 陳吉華 王疆

各類樹脂修復材料以及依靠樹脂水門汀粘接的全瓷修復體應用日益廣泛，但大量臨床調查及研究均指出，修復體粘接強度不足和邊緣牙體組織繼發齲仍是目前導致口腔粘接修復失敗的最常見的兩個原因［1－2］。眾多學者和牙科材料廠商圍繞這兩個薄弱環節進行了大量的研究并推出了多種功能性材料。

偶聯劑能有效地改善界面粘接強度，同時避免機械性表面處理造成的修復體表面結構破壞、適合性降低等問題，在許多粘接修復的過程中使用偶聯劑已成為共識。添加季銨鹽抗菌單體的牙科修復材料，能利用其獨特的接觸殺菌效果持續殺滅存在于牙齒表面或進入粘接界面的細菌，是目前防治齲病最有效、最直接的途徑。盡管偶聯劑和季銨鹽抗菌修復材料的應用能顯著改善粘接效果，但口腔粘接修復步驟相對繁瑣和技術敏感性強的問題仍然困擾著許多臨床醫生。

針對上述情況，課題組在前期研究工作的基礎上，依據口腔粘接修復的特點，設計出一類兼具偶聯和抗菌性能，并能夠與牙科常用甲基丙烯酸酯類樹脂單體聚合的有機硅季銨鹽多功能分子NMOAC（其分子結構式見圖1）。本研究目的在于初步評價NMOAC的偶聯效果和抗菌活性，論證牙科有機硅季銨鹽應用的可行性，并為進一步分子設計和性能改進提供參考。

圖1 甲基丙烯酸酯改性有機硅季銨鹽NMOAC的分子結構式Fig 1 Molecular structure of a methacrylate modified organosilicon quaternary ammonium salt（NMOAC）

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

2-（甲基（十八烷基）（3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基）-λ4-氮烷基）乙基甲基丙烯酸酯氯化銨（NMOAC）、甲基丙烯酰氧基十一烷基甲基二乙氧基硅烷（DMSDIB）、甲基丙烯酰氧乙基－正十六烷基－二甲基氯化銨（DMAE-CB）、2-（甲基丙烯酞氧乙基）－正十六烷基一甲基溴化銨（MAE-HB）由空軍軍醫大學口腔醫學院研制。采用菌株變形鏈球菌ATCC25175、粘性放線菌ATCC15987、金黃色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90028由空軍軍醫大學口腔醫學院檢驗科提供。Porcelain Primer瓷偶聯劑、Biscem自粘接樹脂水門?。˙isco，USA）；E-max鑄瓷塊（Ivoclar Vivadent，Liechtenstein）；胎牛血清（杭州四季青）；腦心浸液培養基（BHI，Oxoid，UK）。

1.2 實驗方法

1.2.1 偶聯性能測試 將合成的有機硅季銨鹽NMOAC和課題組前期研制的長鏈硅烷DMSDIB溶入99%乙醇中，加入少量去離子水和乙酸，調節pH值為4，分別配制成質量濃度為2%的兩種硅烷溶液；選取成品瓷偶聯劑Porcelain Primer作為標準對照。

將直徑15 mm、厚4 mm的圓盤狀鑄瓷基底和直徑6 mm、厚2 mm的圓盤狀鑄瓷片被粘體依次用320＃、500＃、1 000＃水砂紙磨光，超聲清洗5 min，吹干。用打孔機在聚乙烯薄膜（厚約50μm）上制備直徑2 mm的圓孔，然后將聚乙烯薄膜粘在瓷基底中央以控制粘接面積與樹脂水門汀厚度。根據不同偶聯劑分為3組，每組20個樣本。將3種偶聯劑分別涂抹在相應實驗組瓷基底和被粘體的粘接面，靜置60 s后吹干。將Biscem樹脂水門汀調拌后，涂抹于瓷基底表面的聚乙烯薄膜圓孔中，將同樣經過處理的被粘體覆蓋在瓷基底上，50 g砝碼加壓粘接，去除溢出的樹脂水門汀，從各方向光照固化各40 s［3］。

剔除粘接時發生相對位移的試件，各組隨機選取16個粘接樣本進行37℃恒溫水浴24 h，然后隨機取8個粘接試樣進行即刻剪切強度測試，AGS-500萬能材料試驗機（Shimadzu，Japan）上探頭速度設定為0.5 mm/min；每組另外8個試樣進行5～55℃去離子水冷熱循環5 000次（1循環/min），然后進行剪切強度測試。SPSS 20.0軟件（SPSS Inc.，USA）采用 one-way ANOVA及two-way ANOVA（不同偶聯劑處理、冷熱循環前后）分析實驗結果（α＝0.05）。

1.2.2 抗菌活性測試 以液體稀釋法測定有機硅季銨鹽NMOAC和課題組前期研制的兩種季銨鹽單體對4種常見口腔致病菌的抗菌活性。使用BHI液體培養基作為溶劑，配制成初始濃度為50 mg/mL溶液，連續倍比稀釋配制成梯度濃度倍比稀釋液各1 mL。實驗菌株隔夜培養后用細菌比濁儀調整菌液濃度至1×106CFU/mL，每管含有不同濃度單體稀釋液中加入菌液10μL并迅速用渦旋混合器混勻。含變形鏈球菌、粘性放線菌培養管置于37℃厭氧培養箱；白色念珠菌和金黃色葡萄球菌培養管置于37℃空氣培養箱。培養24 h后觀察試管中液體搖勻后仍清亮無混濁的抗菌劑最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。接種環挑取清亮試管中的培養物，劃線接種于BHI瓊脂平板上，孵育48 h，無細菌生長的最低抗菌單體濃度為該抗菌單體的最低殺菌濃度（MBC）。以上步驟重復3次。同時設立陽性和陰性對照，陽性對照不加抗菌單體只加入標化的菌懸液和等量培養基，陰性對照為不加菌懸液和抗菌單體的培養基［4］。

SPSS 20.0軟件對各單體的MIC和MBC值進行方差分析以及LSD檢驗（α＝0.05）。

2 結 果

2.1 粘接強度

經不同偶聯劑處理后，瓷試件剪切粘接強度的結果詳見圖2。有機硅季銨鹽NMOAC處理的試件，即刻粘接強度與Porcelain Primer處理組、長鏈硅烷DMSDIB處理組之間無顯著差異（P＞0.05）；老化處理后各組瓷粘接強度均明顯降低（P＜0.05），其中NMOAC和DMSDIB處理組的老化粘接強度均顯著高于Porcelain Primer處理組（P＜0.05）。

圖2 不同偶聯劑處理后瓷粘接的即刻剪切強度與老化粘接強度（MPa）Fig 2 The immediate and aging shear bond strength between resin cement and porcelain treated with different coupling agents（MPa）

2.2 MIC/MBC值測定

有機硅季銨鹽NMOAC和2種季銨鹽單體對4種口腔致病菌的MIC/MBC值見表1。NMOAC對4種口腔常見致病菌均表現出較強的抗菌活性，MIC值介于6.1～24.4μg/mL之間，作用于相同菌株時 NMOAC與課題組前期研制的兩種季銨鹽單體（MAE-HB和DMAE-CB）的 MIC值之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同季銨鹽對4種口腔病原菌的MIC/MBC值Tab 1 MIC/MBC values of different quaternary ammonium salts against4 oral pathogenic bacterias

3 討 論

目前瓷貼面、嵌體等修復體粘接的臨床操作仍相對繁瑣，具有較強的技術敏感性，許多初學者往往因為不能完全掌握粘接修復的步驟和技術要點而導致最終修復效果大打折扣。有研究顯示，熟練掌握口腔粘接技術的專業人員粘接的瓷貼面能夠承受約25 MPa以上的剪切力［5］，臨床壽命甚至高達 20年以上［6］；而缺乏粘接經驗的牙科醫生或實習生粘接的瓷貼面短期失敗率則高達34.48%［7］。如果有一種材料能夠同時行使硅烷偶聯劑和季銨鹽抗菌單體的功能，甚至將粘接劑的功能合而為一，那么粘接修復臨床操作的步驟也將從3～4步簡化為2步甚至是1步，既方便初學者掌握，又能降低操作失誤的概率，對于口腔粘接修復技術的進一步推廣具有重大意義。

查閱文獻后，作者發現紡織品表面抗菌劑有機硅季銨鹽DC-5700結構中同時具備硅氧烷基團和陽離子季銨基團這兩種特征官能團［8］，與牙科材料中使用的硅烷偶聯劑和季銨鹽抗菌單體有類似之處，但缺乏能與牙科常用樹脂單體共聚的甲基丙烯酸酯基團。課題組嘗試進行分子設計，以18烷基溴、2-（甲氨基）乙醇等為起始原料，通過親核加成反應、酯化反應和季銨化反應三個核心環節，最終獲得甲基丙烯酸酯改性有機硅季銨鹽NMOAC。經過化學結構鑒定，證實這種分子同時具備硅氧烷基團、陽離子季銨基團和甲基丙烯酸酯基團（其MS鑒定譜見圖3）。本研究的目的在于驗證改性的有機硅季銨鹽NMOAC是否能正常行使偶聯劑和季銨鹽抗菌劑的功能。

圖3 有機硅季銨鹽NMOAC的結構鑒定譜（MS）Fig 3 Structure identification spectrum（MS）of NMOAC

作為偶聯劑使用時，即刻粘接強度測試結果顯示有機硅季銨鹽NMOAC溶液處理后的瓷粘接強度與商品偶聯劑Porcelain Primer以及課題組前期合成的長鏈硅烷DMSDIB效果相當，說明NMOAC分子中的硅氧烷基團能夠正常水解并與瓷表面的羥基等結構發生反應，甲基丙烯酸酯基團或疏水碳鏈能與樹脂單體相結合，正常行使偶聯功能，促進粘接強度提高。尤其值得注意的是，老化處理后NMOAC和DMSDIB處理組的瓷粘接強度均顯著高于Porcelain Primer處理組P（P＜0.05）。推測這是由于課題組合成的NMOAC分子與DMSDIB分子的碳鏈長度均比牙科常用硅烷分子γ-MPS長，根據變形層理論，硅烷偶聯劑分子長度在一定范圍內增加時能形成模量遞減的拘束層，可以緩和界面應力［9］，拉緊界面上粘接劑的結構，從而達到增韌的效果，這與課題組前期研究結果相符［10］。

抗菌活性測試結果顯示甲基丙烯酸酯改性有機硅季銨鹽NMOAC對4種口腔常見致病菌均表現出較強的抗菌活性。季銨鹽類抗菌單體的抗菌性能與其化學結構有密切關系，其中季銨基團中疏水碳鏈長度的影響最為顯著［11］。細菌細胞膜系統中磷脂的疏水端碳鏈長度為17左右，所以當季銨鹽單體N端攜帶碳鏈長度在17左右時，由于其結構和磷脂相似，疏水尾更容易插入細胞膜，破壞細胞膜穩定性，造成菌體死亡。本研究中用于對照的兩種季銨鹽單體MAE-HB和DMAE-CB的疏水碳鏈長度分別為C17和C16，而有機硅季銨鹽NMOAC的疏水碳鏈長度為C18，三者發揮抗菌作用的疏水碳鏈長度接近，因而表現出相似的抗菌活性。研究結果同時也證實，NMOAC中親水的硅氧烷基團并未影響到N端疏水碳鏈的抗菌效能。

本研究驗證了NMOAC分子的偶聯效能和抗菌活性，初步證實了甲基丙烯酸酯改性的有機硅季銨鹽用于牙科材料領域的可行性，為粘接修復臨床操作步驟的簡化提供了可能，關于其交聯性能和長期穩定性仍有待進一步研究。