杜仲葉茯磚茶加工過程中活性成分及微生物多樣性

曾 橋，段 潔，邊文文，劉 靜，余鄭綠，胡 歆，楊文娟，呂生華

（1.陜西科技大學輕工科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；3.陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西 西安 710048；4.陜西樸道茶業股份有限公司，陜西 西安 713700；5.咸陽涇渭茯茶有限公司，陜西 咸陽 712000）

茯磚茶為黑茶類全發酵茶[1]，傳統上主要以黑毛茶為原料，經原料篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發花干燥和陳化等一系列復雜工藝制作而成，為所有黑茶中加工工藝最復雜、最獨特的產品[2-3]。其中發花是以冠突散囊菌為主的多菌群發酵過程，為決定茯磚茶品質的關鍵制作工序，對于形成茯磚茶金花普茂、菌香濃郁、湯色紅濃、口感醇厚的獨特特征和風味具有重要作用。研究表明，茯磚茶具有降脂減肥、抗氧化、抗腫瘤和抑菌等[4-7]多種保健作用，近年來受到消費者的青睞。

杜仲為杜仲科杜仲屬植物，為我國特有樹種。杜仲可利用程度高，其皮和葉為名貴中藥材，杜仲雄花、杜仲籽為新資源食品。《中國藥典》記載杜仲樹皮性甘、溫，而杜仲葉微辛、溫，二者歸肝、腎經，具有補肝腎、強筋骨的功能，常用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩。傳統上杜仲主要以皮入藥，對葉的利用相對較少。研究表明，杜仲葉含有豐富的黃酮、綠原酸、多糖、氨基酸、木質素、環烯醚萜類、多酚等[8-12]活性成分，具有降血壓、降血脂、抗疲勞、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗骨質疏松等作用[13-17]，早在2002年就被列入保健食品物品名單。2019年11月25日，國家衛生健康委發布公告，對杜仲葉等9 種物質開展按照藥食同源物質生產經營試點工作，進一步擴大了杜仲葉的應用范圍，這對于促進杜仲產業持續健康發展具有重要意義。杜仲葉作為可再生資源，在我國分布廣泛，產量巨大，但仍有待于開發和利用。

當前，杜仲葉的開發主要以杜仲葉茶為主，包括杜仲葉綠茶、杜仲葉普洱茶、杜仲茶粉、杜仲茶飲料以及以杜仲葉為主的拼配茶等[18]，然而現有杜仲葉茶普遍青辛味較重，茶湯發綠或發黑，滋味略苦，口感較差，因而未得到市場廣泛認可。茯磚茶加工工藝復雜，其獨特的發花工藝不僅賦予了茯磚茶金花普茂的特征，而且可有效改善其風味和口感，從而大幅提升產品品質，為此，本課題組前期以采摘于陜西漢中略陽的杜仲葉為原料，經殺青、揉捻、干燥等工藝制成杜仲葉茶，進一步采用茯磚茶加工工藝制作成杜仲葉茯磚茶，不僅豐富了茯磚茶產品類型，而且為促進杜仲葉的高值化利用提供了新的途徑和方法。本實驗在杜仲葉茯磚茶成功制作基礎上，對杜仲葉茯磚茶加工過程中主要活性成分以及微生物群落結構變化進行了研究，并對兩者相關性進行分析，旨在揭示杜仲葉茯磚茶的品質形成機制，為生產高品質的杜仲葉茯磚茶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉于2019年5月采于陜西省略陽縣。

綠原酸、梔子苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、葡萄糖、蘆丁、咖啡因、谷氨酸、沒食子酸標準品 上海源葉生物科技有限公司；乙腈、乙酸、甲醇、磷酸（均為色譜純） 德國Fisher公司；濃硫酸、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙二胺四乙酸二鈉、茚三酮（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、堿式乙酸鉛、碳酸鈉、福林-酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化亞錫（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；苯酚、無水乙醇、甲醇（均為分析純） 天津市天力化學試劑有限公司。

土壤基因組DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuDNA聚合酶北京全式金生物技術有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒 美國Bioo Scientific公司；測序試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器和Chromeleon 7.10色譜工作站） 美國Thermo-Fisher Scientific公司；UV-1100紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；FA2004電子分析天平 上海精科天平有限公司；EX125DZH電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-GF101-2-BS-II電熱鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械有限公司；KH5200DE型醫用數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠；DW-86L486超低溫冰箱青島海爾生物醫療股份有限公司；TD5A大容量低速離心機 長沙英泰儀器有限公司；FD5-2.5冷凍干燥機美國SIM公司；ELx800酶標儀 美國BioTek公司；QuantusTMFluorometer微型熒光計 美國Promega公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；Illumina Miseq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 杜仲葉茯磚茶的制作工藝

以同一批次杜仲葉茶（陜西略陽）為原料，經篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發花干燥、陳化等工藝制成。分別于加工過程中的原料篩選、渥堆、氣蒸與壓制成型（即發花0 d），發花4、8、12、18、25 d及陳化1 年這9 個時間點取樣，依次編號為S0～S8，所有樣品分別取樣約200 g，無菌包裝袋密封后貯藏于－80 ℃條件下待用。

1.3.2 杜仲葉茯磚茶中活性成分分析

將貯存于－80 ℃下各樣品冷凍干燥后進行活性成分分析。水浸出物質量分數參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》進行測定；多糖質量分數參考文獻[19]進行測定；總黃酮質量分數參照文獻[20]進行測定；咖啡堿質量分數參考GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》進行測定；游離氨基酸質量分數參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》進行測定；多酚質量分數參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行測定；綠原酸質量分數參考文獻[21]進行測定；京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質量分數參考文獻[22]進行測定。

1.3.3 杜仲葉茯磚茶中微生物的DNA提取和PCR擴增

采用土壤基因組DNA提取試劑盒分別提取S0～S8階段樣品總DNA，使用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop 2000測定DNA質量濃度和純度。提取后的各樣品DNA進行PCR擴增，細菌16S rDNA V3～V4區引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），真菌ITS擴增區引物為ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）。PCR程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個循環；72 ℃穩定延伸10 min，最后在10 ℃保持至停止。

1.3.4 杜仲葉茯磚茶中微生物的16S rDNA和ITS序列高通量測序

將1.3.3節得到的PCR產物混合后使用質量分數2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer微型熒光計對回收產物進行檢測定量，使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，在上海美吉生物醫藥科技有限公司基于Illumina平臺對細菌V3～V4和真菌ITS1區序列進行高通量測序分析。

1.4 數據處理與分析

各不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣活性成分檢測均重復3 次，數據用平均值±標準差表示，活性成分實驗結果均采用Graph Pad Prism軟件進行分析，采用t檢驗進行多重比較，相關性分析采用SPSS Statistics 20軟件處理。原始測序數據分別使用Trimmomatic和FLASH軟件進行質控和拼接[23]，進一步使用UPARSE軟件根據97%的相似度對序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析[24]，利用RDP Classifier對每條序列進行物種分類注釋，16S細菌和ITS真菌分別使用Silva數據庫和Unite真菌數據庫進行比對，確定生物分類信息[25]。

2 結果與分析

2.1 杜仲葉茯磚茶不同加工階段活性成分變化

杜仲葉茯磚茶加工過程中水浸出物、多糖、總黃酮、咖啡堿、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸以及桃葉珊瑚苷等活性成分質量分數變化見表1。

表1 杜仲葉茯磚茶不同加工階段活性成分質量分數分析Table 1 Analysis of bioactive components content of samples from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves%

由表1可知，杜仲葉茯磚茶中活性成分較為豐富，其中水浸出物、多糖、總黃酮等常見活性成分質量分數均高于傳統茯磚茶[26]。在S0～S8階段，檢測的所有活性成分質量分數均呈下降趨勢，其中與S0階段相比，S8階段的水浸出物、咖啡堿質量分數分別下降6.68%和24.00%，差異顯著，但未達到極顯著水平（P＞0.01）。多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷的質量分數在加工過程中明顯下降，和S0階段相比，S8階段上述活性成分質量分數分別下降29.60%、32.79%、26.19%、30.71%、62.91%、65.63%、10.83%和30.61%，差異均極顯著（P＜0.01）。

進一步對各主要活性成分分析可以發現：在杜仲葉茯磚茶加工程中，水浸出物質量分數主要在發花中期（S4～S5）以及陳化過程中（S7～S8）下降較快，分別下降2.29%和2.91%，上述兩個階段水浸出物下降量占總下降量的76.02%，這可能是由于S4～S5階段冠突散囊菌生長旺盛，消耗了大量的營養成分，而S7～S8階段下降較快可能是間隔時間較長導致的。杜仲葉茯磚茶中多糖質量分數較高，和其他活性成分不同的是，多糖質量分數在S0～S6階段逐步下降，而在發花后期及陳化階段（S6～S8）多糖質量分數又逐漸上升。進一步分析發現，S5～S6階段下降最為明顯，多糖質量分數差異顯著（P＜0.05），這可能是由于一方面冠突散囊菌的生長繁殖利用多糖作為碳源；另一方面糖類物質自身在發酵所產生的較高溫度作用下發生了脫水、縮合、聚合等焦糖化反應，從而產生令人愉快的湯色和焦糖香[27]。而S6～S8階段多糖質量分數上升可能是由于冠突散囊菌等微生物所產生的胞外酶將茶磚中的粗纖維降解為可溶性糖，從而使多糖含量有所增加[28]。總黃酮、游離氨基酸和多酚質量分數在杜仲葉茯磚茶加工過程中變化趨勢類似，S0、S1和S2階段中總黃酮、游離氨基酸和多酚質量分數均呈下降趨勢，但差異未達到極顯著水平（P＞0.01）。從S3階段開始，樣品中總黃酮質量分數與S0階段相比，差異達到極顯著水平（P＜0.01），而多酚、游離氨基酸質量分數從S4階段起，與S0階段相比差異達到極顯著水平（P＜0.01）。綠原酸為杜仲葉中重要活性成分，在杜仲葉茯磚茶加工前期S0～S3階段含量變化不大，而S3～S8階段，綠原酸質量分數大幅下降，除S6和S7兩個階段質量分數差異未達到極顯著水平外（P＞0.01），其余各階段相互之間綠原酸質量分數差異均達到極顯著水平（P＜0.01）。京尼平苷和桃葉珊瑚苷在杜仲葉茯磚茶中質量分數均較低，其中，京尼平苷在加工過程中變化較桃葉珊瑚苷明顯，且京尼平苷質量分數下降主要集中于S3～S6階段。京尼平苷酸質量分數下降主要為S1～S2階段，S2較S1階段質量分數下降5.88%，占整個加工過程中下降總量的53.85%，這可能由于京尼平苷酸熱穩定性不高，因而在氣蒸時使其部分降解造成質量分數下降較快。

2.2 杜仲葉茯磚茶加工過程中微生物群落結構

2.2.1 不同加工階段真菌群落結構

由圖1A可知，S0～S8階段樣品的真菌群落基于門分類水平注釋到明確分類地位的有3 個門，其他相對豐度較低的合并為一類（其他）。子囊菌門（Ascomycota）在所有樣品中均為優勢菌，相對豐度介于67.52%～100%。從各樣品來看，S0階段樣品中子囊菌門的相對豐度為91.63%，其次是相對豐度為8.07%的擔子菌門（Basidiomycota）以及少數未知分類地位的unclassified_k_Fungi及其他的真菌。而經過渥堆處理，子囊菌門的相對豐度下降至67.52%，至S2階段，其相對豐度逐漸上升，特別是從S4階段起，子囊菌門在各樣品中的相對豐度均在99.99%以上，占絕對優勢。

圖1 基于門（A）和屬（B）水平不同加工階段杜仲葉茯磚茶真菌群落結構Fig. 1 Fungal community structure of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves at phylum (A) and genus (B) levels

由圖1B可知，S0～S8階段樣品的真菌群落在屬分類水平上注釋到明確分類地位的有23 個屬，其他相對豐度較低的合并為一類（其他）。其中相對豐度較高的有曲霉屬（Aspergillus）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、Cutaneotrichosporon、Apiotrichum、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、節擔菌屬（Wallemia）、枝孢屬（Cladosporium）、念珠菌屬（Candida）、青霉屬（Penicillium）和Cyberlindnera等，曲霉屬在所有樣品中的相對豐度均較高，在各不同加工階段相對豐度介于56.34%～100%，為杜仲葉茯磚茶中的優勢菌群。通過對不同加工階段分析可以發現，S0～S2階段，曲霉屬相對豐度逐步下降，Cutaneotrichosporon相對豐度逐步上升，毛孢子菌屬相對豐度呈先上升后下降趨勢，微生物多樣性發生了較明顯的變化。隨著發花的進行，至S3階段，曲霉屬相對豐度大幅上升，達到了95.58%，而在S4～S8階段，其相對豐度均在99.99%以上，為杜仲葉茯磚茶中的絕對優勢菌群。

2.2.2 不同加工階段細菌群落結構

由圖2A可知，在門分類水平上，不同加工階段杜仲葉茯磚茶樣品的細菌群落共注釋到7 個明確分類地位的門，分別為放線菌門（Actinobacteriota）、藍細菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、Bacteroidota、Acidobacteriota和綠彎菌門（Chloroflexi）。不同加工階段樣品在門水平上微生物的組成有較大差異，在S0～S2階段，藍細菌門為優勢菌，其相對豐度介于73.73%～93.19%，其次為變形菌門，相對豐度為3.97%～20.16%。而在發花初期的S3、S4階段，變形菌門為優勢菌，相對豐度分別為60.68%和66.53%，其次為藍細菌門、厚壁菌門和放線菌門。在發花中后期及陳化階段，即S5～S8階段，各樣品在門水平上的菌群結構較相似，放線菌門在各樣品中均為優勢菌，相對豐度均在83.35%以上，其次為變形菌門，在各樣品中相對豐度介于10.92%～13.31%，說明門水平上細菌群落結構趨于穩定。

圖2 基于門（A）和屬（B）水平不同加工階段杜仲葉茯磚茶細菌群落結構Fig. 2 Bacterial community structure of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves at phylum (A) and genus (B) levels

由圖2B可知，基于屬水平的S0～S8階段樣品的細菌群落共注釋到明確分類地位的屬有47 個，其余相對豐度較低的合并為一類（其他），其中相對豐度較高的為紅球菌屬（Rhodococcus）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、不動桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、norank_f_Mitochondria、泛菌屬（Pantoea）、屬級分類地位未知的黃色桿菌屬（unclassified_f_Xanthobacteraceae）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Terrisporobacter、魏斯氏菌屬（Weissella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）等。在S0～S4階段，雷爾氏菌屬為各樣品中的優勢菌，其相對豐度介于29.45%～55.74%，其次為紅球菌屬（4.31%～6.83%）和Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia（4.01%～7.79%）。從S5階段起，雷爾氏菌屬在此后各樣品中的相對豐度大幅下降，S5～S8階段，雷爾氏菌屬在各樣品中的相對豐度為8.43%～9.90%，紅球菌屬從S5階段起，在各樣品中的相對豐度則大幅上升，在S5～S8階段，其相對豐度84.70%～88.02%，為優勢菌群。整體來看，杜仲葉茯磚茶加工過程中，S0～S4階段各樣品細菌群落多樣性明顯高于S5～S8階段，而S4～S5階段為杜仲葉茯磚茶中細菌群落多樣性發生變化的關鍵階段。

2.2.3 主成分分析和OTU聚類分析結果

2.2.3.1 真菌主成分分析和維恩圖分析結果

通過主成分分析（principal component analysis，PCA）杜仲葉茯磚茶不同加工階段茶樣的OTU組成來反映樣品間的差異和距離，樣品組成越相似，則反映在PCA圖中的距離越近。由圖3A可以看出，PC1和PC2的主要貢獻之和為99.46%，說明該PCA結果可以較好地反映不同茶樣間真菌群落結構差異的影響因素。S0、S1、S2階段各樣品相互之間距離均較遠，說明真菌群落結構差異較大，S3～S8階段的各樣品在PCA圖上聚集在一起，說明S3～S8階段各樣品真菌群落結構相似，而與S0、S1、S2階段各樣品間距離較遠，表明S0、S1、S2階段和S3～S8階段樣品相互間真菌群落結構差異較大。

將S0、S1、S2階段樣品分別記為Group1、Group2和Group3，而S3～S8階段的各樣品因群落結構相似而歸為一組，記為Group4，進一步對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析并繪制維恩圖。從圖3B可以看出，所有4 組樣品可以劃分為156 個OTU，S0、S1、S2和S3～S8組樣品OTU分別為69、77、61 個和63 個。其中，S0～S1、S2、S3～S8組中OTU分別為28、25 個和18個，S1與S2、S3～S8組共有OTU分別為44 個和31 個，而S2與S3～S8組共有OTU為32 個。S0、S1、S2和S3～S8組各自獨有的OTU分別為37、25、10 個和22 個，分別占各自OTU總數的53.62%、32.47%、16.39%和34.92%，而S0、S1、S2和S3～S8組4 組樣品共有的OTU為12 個，占所有4組樣品OTU總數的7.69%，說明4 組樣品真菌群落組成有明顯的不同。

圖3 杜仲葉茯磚茶不同加工階段真菌群落PCA（A）和OTU的維恩圖分析（B）Fig. 3 Principal component analysis (A) and Venn diagram analysis of OTU distribution (B) of fungal communities in samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

2.2.3.2 細菌PCA和維恩圖分析結果

由圖4A可知，不同加工階段細菌群落PCA圖中PC1為93.55%，PC2為6.33%，合計為99.88%，說明該PCA結果可以較好地反映不同茶樣間細菌群落結構差異的影響因素。S0、S1和S2階段樣品在PCA圖上距離較近，說明組成上較為相似，而S3和S4階段樣品距離較近，說明S3和S4階段樣品細菌群落組成相似，同時S3和S4與S0、S1、S2階段樣品呈明顯的分離狀態，說明細菌群落組成與S0、S1、S2階段樣品有較明顯的差異。S5、S6、S7和S8階段樣品在PCA圖上聚集在一起，說明S5～S8階段各樣品細菌群落組成相似，同時與其他樣品距離較遠，說明與其他階段樣品細菌群落組成有明顯的差異。

圖4 杜仲葉茯磚茶不同加工階段細菌群落PCA（A）和OTU的維恩圖分析（B）Fig. 4 Principal component analysis (A) and Venn diagram analysis of OTU distribution (B) of bacterial communities in samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

為便于進行OTU分析，將在PCA圖上距離較近的樣品分為一組，即S0、S1、S2階段樣品合并為Group1，S3和S4階段樣品合并為Group2，S5、S6、S7和S8階段樣品歸為Group3，進一步對97%相似水平下的OTU進行生物信息學統計分析并繪制維恩圖。由圖4B可知，3 組樣品一共可以劃分為1 250 個OTU，Group1、Group2和Group3各組樣品OTU分別為555、885 個和542 個。其中，Group1和Group2共有的OTU為359 個，和Group3共有的OTU為253 個，Group2和Group3共有的OTU為341 個。Group1、Group2和Group3各組獨有的OTU為164、406 個和169 個，分別占各自OTU總數的29.55%、45.88%和31.18%，而3 組共有的OTU為221 個，占所有組OTU總數的17.68%，說明杜仲葉茯磚茶加工過程中細菌群落結構發生了明顯的變化。

2.3 屬水平主要菌群與活性成分相關性分析結果

表2為S0～S8階段杜仲葉茯磚茶活性成分質量分數與屬水平上相對豐度較高菌群之間相關性分析，由表2可知，曲霉屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質量分數均顯著負相關（P＜0.05），Apiotrichum相對豐度與多糖、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷和桃葉珊瑚苷質量分數均顯著正相關（P＜0.05），與總黃酮質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），節擔菌屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚質量分數顯著正相關（P＜0.05），紅球菌屬相對豐度與水浸出物、多糖、總黃酮、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷質量分數均呈極顯著負相關（P＜0.01），與京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷質量分數顯著負相關（P＜0.05），雷爾氏菌屬和Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia相對豐度均與水浸出物質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），二者相對豐度與綠原酸和京尼平苷質量分數均顯著正相關（P＜0.05），芽孢桿菌屬相對豐度與多糖、游離氨基酸、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質量分數均顯著正相關（P＜0.05）。此外，毛孢子菌屬、Cutaneotrichosporon、德巴利酵母屬、不動桿菌屬和乳桿菌屬相對豐度與主要活性成分質量分數相關性均不顯著（P＞0.05），咖啡堿質量分數與屬水平上主要菌群相對豐度相關性均不顯著（P＞0.05）。

表2 不同加工階段杜仲葉茯磚茶活性成分質量分數與屬水平主要菌群相對豐度Pearson相關性分析Table 2 Pearson’s correlation between the relative abundance of important genera and bioactive components of samples collected from the manufacturing process of Fuzhuan tea from Eucommia ulmoides leaves

3 討 論

杜仲葉茯磚茶加工過程中活性成分分析結果表明，主要活性成分在加工過程中均呈下降趨勢，比較S8和S0兩個階段活性成分含量可以發現，除水浸出物和咖啡堿差異未達到極顯著外，其余活性成分含量下降差異均達到極顯著水平（P＜0.01），這與以黑毛茶為原料加工的傳統茯磚茶類似。然而，Li Qin等[29]認為，盡管茯磚茶加工和儲藏過程中主要功能成分含量呈下降趨勢，但茯磚茶仍具有較好的保健作用，這是由于茯磚茶生產過程中產生了其他新的成分或茯磚茶中原有的一些成分含量增加的緣故，由于本研究過程中所檢測的活性成分種類有限；因此，杜仲葉茯磚茶是否也存在類似的情況還有待于通過后續深入研究來證實。冠突散囊菌是茯磚茶中的優勢金花菌，屬于曲霉屬真菌[30]，通過對杜仲葉茯磚茶加工過程中屬水平上真菌群落結構分析發現，曲霉屬在S0階段即開始大量存在，渥堆和氣蒸降低了曲霉屬在樣品中相對豐度，而杜仲葉茯磚茶進入發花階段后，由于環境溫度和濕度適中，金花菌大量生長繁殖，因此在S2～S3階段曲霉屬豐度大幅上升，從S4階段起，曲霉屬在樣品中的相對豐度已達到了99.99%以上。由于冠突散囊菌是衡量茯磚茶品質的重要指標，因此，曲霉屬在杜仲葉茯磚茶中的豐度高，間接說明工藝控制良好，產品質量較高。Li Qin等[29]對以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中真菌群落變化進行了研究，結果發現，在以黑毛茶為原料加工茯磚茶過程中曲霉屬相對豐度在渥堆和氣蒸階段呈上升趨勢，而在進入發花室后的0～3 d，曲霉屬相對豐度呈下降趨勢，這與杜仲葉茯磚茶有明顯不同，說明原料不同對茯磚茶加工前期樣品中的真菌群落結構有一定影響，但進入發花中期后，曲霉屬在兩種茯磚茶中均為絕對優勢菌群，在中后期及最終產品中各不同原料茯磚茶真菌群落結構差異不大[31]。相關性分析結果表明，曲霉屬相對豐度與杜仲葉茯磚茶加工過程中多數活性成分質量分數顯著負相關（P＜0.05），節擔菌屬相對豐度與多糖、總黃酮、游離氨基酸和多酚質量分數呈顯著正相關（P＜0.05），這與以黑毛茶為原料加工的傳統茯磚茶類似，而在杜仲葉茯磚茶加工過程中豐度較高的Apiotrichum在傳統茯磚茶中未發現[29]。細菌是茯磚茶加工過程中非常重要的菌群，但由于發酵過程中細菌數量相對于真菌處于劣勢地位，因而沒有受到研究者重視[32]。紅球菌屬、雷爾氏菌屬、Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia、不動桿菌屬、芽孢桿菌屬和乳桿菌屬是杜仲葉茯磚茶加工過程中主要的細菌屬，其中，紅球菌屬相對豐度僅與所檢測活性成分中的咖啡堿質量分數相關性不顯著（P＞0.05），而與其余9 種活性成分質量分數均呈顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）負相關，雷爾氏菌屬、Burkholderia-Caballeronia Paraburkholderia相對豐度與水浸出物、綠原酸和京尼平苷質量分數顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關，而芽孢桿菌屬相對豐度與多糖、游離氨基酸、京尼平苷酸和桃葉珊瑚苷質量分數呈顯著正相關（P＜0.05），這說明細菌在杜仲葉茯磚茶加工過程中可能發揮了重要的作用，在后續研究中應予以重視。

綜上，杜仲葉茯磚茶中水浸出物、多糖、總黃酮、咖啡堿、游離氨基酸、多酚、綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸以及桃葉珊瑚苷10 種活性成分質量分數在加工過程中呈逐步下降趨勢。杜仲葉茯磚茶在加工前期（S0～S4階段）真菌和細菌屬菌群均較加工后期（S5～S8階段）豐富，發花后期以及陳化階段，杜仲葉茯磚茶中微生物菌群逐漸趨于穩定。屬水平上主要菌群相對豐度與活性成分質量分數的相關性分析結果表明，杜仲葉茯磚茶加工過程中細菌和真菌豐度與多樣性均可能對活性成分的變化產生影響。研究結果可為進一步通過定向調控菌群結構提高杜仲葉茯磚茶發花質量和產品品質提供理論依據。