金雀異黃酮通過調控Ca2＋-CaMKIV通路對Aβ25-35誘導海馬神經元損傷的保護作用

高華武，王 艷，周 鵬，葉 樹，宋 航，汪光云，蔡 標,*

（1.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院中西醫結合研究所，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關的慢性、神經退行性疾病，伴隨著記憶缺失和認知功能障礙，并最終會導致患者死亡。AD是誘發進行性癡呆的主要病因之一，據估計，目前中國有1 000萬AD患者，美國有580萬AD患者，到21世紀中葉，全球癡呆患者將達到1.52億，其中約60%～70%為AD患者[1-2]。AD的發病機制復雜，至今臨床上常用的抗AD藥物效果不理想，從天然產物及其衍生物中研制抗AD的新型藥物已成為研發的重要方向，并且眾多研究結果證實天然產物及其衍生物在改善AD進程方面具有很好的療效[3-4]。

金雀異黃酮（genistein，GS），化學名稱為4’,5,7-三羥異黃酮，是大豆異黃酮的主要成分，約占大豆中總異黃酮的60%[5]，廣泛存在于大豆、玉米、大麥、小麥、黑麥等各種可食用的植物中，在大豆中最為豐富[6]。金雀異黃酮在化學結構上類似于17-β-雌二醇，有研究用金雀異黃酮模擬雌激素與其受體結合，發現其可在靶器官中發揮雌激素作用，但沒有雌激素的不良反應[6-8]，對更年期癥狀和更年期相關疾病，如骨質疏松癥、肥胖癥、糖尿病、焦慮癥、抑郁癥和乳腺癌等[5,9-10]有很好的療效。在AD防治方面，金雀異黃酮可以縮短AD模型動物逃避潛伏期和降低錯誤次數，改善學習記憶能力，改善大腦功能[11-12]，其機制可能與減少β淀粉樣蛋白（beta amyloid peptide，Aβ）沉積、抑制細胞凋亡、減少氧化應激和神經炎癥、誘導自噬等途徑等有關[13-15]，但是金雀異黃酮的作用機制仍然有待進一步研究。

研究表明，Ca2＋-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IV（calmodulin-dependent protein kinase IV，CaMKIV）信號通路在AD的發病中起著重要的作用。Aβ在神經元細胞中的沉積導致Ca2＋濃度增加，超載的Ca2＋和鈣調蛋白（calmodulin，CaM）的結合激活了鈣-鈣調素復合物（Ca2＋/CaM）的活性。進入細胞核后，Ca2＋/CaM激活鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶激酶（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase，CaMKK）及其底物CaMKIV促使環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）激酶磷酸化，進而磷酸化Tau，過度磷酸化的Tau蛋白是異常神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）的主要組成部分，是AD臨床表達的重要因素。因此，通過CaM-CaMKIV信號通路抑制Tau蛋白過磷酸化是預防和治療AD的重要方法[16-17]。本實驗用Aβ25-35誘導海馬神經元損傷建立AD細胞模型，以抑制Ca2＋超載和介導Ca2＋-CaMKIV信號通路為切入點，觀察金雀異黃酮對海馬神經元損傷的保護作用，探討金雀異黃酮對海馬神經元保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級24 h內新生SD乳鼠（生產許可證號：SCXK（皖）2017-001），雌雄各半，購自安徽省動物實驗中心。動物飼養于安徽省中醫藥科學院中西醫結合研究所，控制室溫18～25 ℃、相對濕度40%～70%。實驗過程中對動物的處置已通過安徽中醫藥大學動物倫理委員會批準。

金雀異黃酮（純度≥98%，批號：C1431028） 上海Aladdin公司；戊酸雌二醇（estradiol valerate，EV）片（批號：185A） 法國DELPHARM Lille S.A.S公司；Aβ25-35（批號：095M4775V） 美國Sigma公司；Hoechst 33258 上海百豪生物科技有限公司；抗MAP-2的小鼠抗體（1∶200）、Cy3標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G抗體（1∶200） 北京Bioss公司；Hoechst 33258（5 μg/mL） 上海Beyotime公司；CaM、CaMKK抗體 英國Abcam公司；CaMKIV、tau抗體 美國Cell Signaling technology公司。

1.2 儀器與設備

BD C6流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；FluorChem M凝膠成像系統 美國ProteinSimple公司；042BR12088電泳儀 美國Bio-Rad公司；IX81倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；AE2000倒置顯微鏡 廈門Motic公司；多功能酶標儀 上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海馬神經元的原代培養

取新生SD乳鼠，體積分數75%乙醇溶液中浸泡20 s消毒后頸椎脫臼處死，剝離海馬組織，用0.125%（體積分數，下同）胰酶消化20 min，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液終止消化，反復吹打形成細胞懸液，200 目篩過濾后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，在沉淀中加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基，吹打均勻后，調整細胞密度至1×106cells/mL，然后接種至由多聚賴氨酸覆蓋的細胞板中，放入37 ℃、5% CO2培養箱培養。培養基在24 h后更換為神經元培養液（100 mL neurobasal-A＋2 mL B27＋252 μL 0.2 mol/LL-谷氨酰胺），之后每隔3 d換1/2體積培養液。在培養期間，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化。

1.3.2 神經元的免疫熒光法鑒定

細胞爬片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L pH 7.4，下同）浸洗2 次，加入4%質量分數多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3 次，每次5 min。加3%山羊血清溫育30 min阻斷非特異性反應性，加入兔抗MAP-2（1∶200），并放入濕盒，在4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3 次后，加Cy3標記山羊抗小鼠IgG（1∶200），濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3 次，加入Hoechst 33258染色液，染色10 min，用PBS洗滌3 次。利用抗猝滅封片液封片，隨后在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 實驗分組、造模和干預

根據本課題組海馬神經元損傷模型方法[18]及預實驗結果，乳鼠原代海馬神經元細胞按1×106cells/mL濃度加入96 孔板中，按照實驗設計將細胞分為4 組：空白對照組、模型組、GS組和陽性對照EV組，除空白對照組外，其他組神經元加入含有Aβ25-35的培養基（30 μmol/L）孵育24 h，建立海馬神經元損傷模型；在造模前，GS和EV組分別用50 μmol/L金雀異黃酮和10 μmol/L EV預處理3 h，空白對照組加入新鮮神經元培養液100 μL。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 MTT法檢測海馬神經元存活率

神經元經過造模和干預后，于培養箱內孵育24 h，棄去培養液，加PBS潤洗2 遍，每孔加入20 μL 5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT），孵育4 h后棄去培養液，加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測每孔OD值。實驗重復3 次。按下式計算神經元存活率。

1.3.4.2 熒光探針檢測海馬神經元Ca2＋熒光強度

熒光探針fluo-3 AM用無Ca2＋細胞外液（135 mmol/L NaCl、2 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、4 g/L葡萄糖）稀釋成工作濃度5 μmol/L。神經元經過造模和干預后，孵育24 h，每孔加入1 mmol/L fluo-3 AM 5 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 次，流式細胞儀檢測細胞內Ca2＋熒光強度（以發出熒光細胞的比例計）。

1.3.4.3 Western blot測定海馬神經元相關蛋白的表達

神經元經過造模和干預后，孵育24 h，棄上清液，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測總蛋白質量濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（CaM、CAMKK（1∶1 000）、p-CAMKIV（1∶800）、p-Tau（1∶600）），4 ℃過夜，Tris-HCl緩沖液（含1% Tween 20）洗滌3 次，加入山羊抗兔IgG（1∶20 000），室溫下孵育1.5 h，TBST洗滌3 次。使用電化學發光劑，凝膠成像儀拍照和半定量分析。實驗重復3 次。以β-actin作為內參。

1.4 數據統計與處理

選用SPSS 24.0軟件進行數據統計分析，結果以平均值±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較，方差齊采用最小顯著性差異（least significance difference，LSD）法，方差不齊采用Dunnett’s檢驗，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 原代海馬神經元的鑒定結果

免疫熒光法鑒定海馬神經元。微管相關蛋白-2（microtubule-associated protein，MAP-2）是一種神經系統的細胞骨架蛋白，在成熟和未成熟的神經元中都有表達，主要在樹突和細胞體中。MAP-2可以用來識別神經元。海馬神經元培養7 d后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，圖1A紅色熒光為MAP-2，圖1B顯示藍色熒光是被Hoechst 33258標記的細胞核，圖1C為圖1A和圖1B的疊加效果。檢測結果表明MAP-2蛋白陽性表達率為90%以上，海馬神經元細胞分離成功。

圖1 原代海馬神經元的鑒定結果Fig. 1 Identification of primary hippocampal neurons

2.2 金雀異黃酮對神經元損傷模型中神經元存活率的影響

MTT法檢測各組神經元存活率，結果見圖2。神經元經Aβ25-35處理后，模型組神經元存活率為50.4%，與空白對照組相比極顯著降低（P＜0.01），表明造模成功；GS組、陽性對照EV組神經元存活率分別為92.4%、73.1%，與模型組相比神經元存活率極顯著提高（P＜0.01）。

圖2 金雀異黃酮對神經元損傷模型中神經元存活率的影響Fig. 2 Effect of genistein on neuron survival rate in neuron injury model

2.3 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞Ca2＋熒光強度的影響

熒光探針技術檢測細胞內Ca2＋熒光強度。圖3結果顯示，與空白對照組比較，模型組神經元的Ca2＋綠色熒光強度極顯著提高（P＜0.01）；與模型組相比，GS組神經元Ca2＋綠色熒光強度極顯著降低（P＜0.01），陽性對照EV組神經元Ca2＋綠色熒光強度有一定程度降低，但差異無統計學意義。

圖3 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞Ca2＋熒光強度的影響Fig. 3 Effect of genistein on intracellular Ca2+ fluorescence intensity in neuron injury model

2.4 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達的影響

Western blot法檢測得到的Ca2＋-CaMKIV通路相關蛋白表達結果見圖4。與空白對照組比較，模型組神經元CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達極顯著升高；與模型組比較，GS和陽性對照EV組CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達極顯著降低（P＜0.01）。

圖4 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞相關蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of genistein on the expression of cell-related proteins in neuronal injury model

2.5 金雀異黃酮對神經元損傷模型中p-Tau蛋白表達的影響

Western blot法檢測p-Tau蛋白的表達結果見圖5。與空白對照組比較，模型組神經元p-Tau蛋白相對表達量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，GS和EV組p-Tau蛋白相對表達量極顯著降低（P＜0.01）。

圖5 金雀異黃酮對神經元損傷模型中細胞p-Tau蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of genistein on the expression of p-Tau protein in neuronal injury model

3 討 論

AD是一種神經系統退行性疾病，海馬神經元的正常結構和功能受損是AD的一個重要病理基礎[19]。海馬區Aβ沉積是老年斑形成的關鍵因素，老年斑引起細胞內鈣離子超載和產生大量自由基，進而促進了Tau蛋白過度磷酸化和NFTs，導致海馬神經元和神經突觸丟失等病理改變[20-21]。金雀異黃酮是一種植物激素，富含于大豆類營養食品，近年來受到廣泛關注，具有改善更年期癥狀、預防骨質疏松、降低乳腺癌發病率等功效，在AD防治方面具有潛力。前期研究發現，金雀異黃酮可能通過下調半胱氨酸蛋白酶-3、Bcl-2相關X蛋白和細胞色素c表達，抑制線粒體凋亡，發揮神經保護作用[22]；可能通過抑制蛋白激酶C通路，減少氧化應激，降低細胞內Ca2＋水平，減少Aβ25-35對PC12細胞的神經毒性[23]。Aβ25-35為阿爾茨海默氏淀粉樣蛋白β肽鏈位于第25～35個氨基酸位點的基因片段，是引起神經毒性的主要活性部位，是目前研究體外復制神經元損傷模型的常用方法之一[24-25]。本實驗經免疫熒光鑒定結果表明，大鼠海馬神經元培養成功。Aβ25-35作用于大鼠原代海馬神經元24 h后經MTT檢測，結果顯示Aβ25-35誘導的海馬神經元存活率極顯著降低，神經元損傷模型成功建立；預先給予金雀異黃酮干預后，可減輕Aβ25-35所致神經元損傷，提高神經細胞存活率，提示金雀異黃酮對Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷模型具有很好的神經保護作用。

Ca2＋是體內最重要的元素之一，Ca2＋穩態對于維持神經細胞的正常生理功能具有重要意義。Ca2＋超載出現在AD病程進展中甚至是AD病理改變早期[26]，Aβ的沉積和Tau蛋白磷酸化會引起細胞質和細胞核Ca2＋超載，進而激活一系列Ca2＋依賴性信號級聯反應。本實驗發現，Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷模型Ca2＋熒光強度極顯著升高，金雀異黃酮預處理可極顯著降低神經元Ca2＋熒光強度，其可能原因是金雀異黃酮抑制了細胞膜上電壓依賴的Ca2＋通道，Ca2＋內流減少[27]，也可能是金雀異黃酮增強了Ca2＋誘導的Ca2＋-突觸結合蛋白等途徑的胞吐作用[28-29]，從而改善Ca2＋超載現象。

Ca2＋-CaMKIV信號通路在神經元傳遞、突出可塑性、神經細胞分化、認知功能等方面具有重要作用[30-31]。Ca2＋-CaMKIV信號通路涉及Ca2＋、CaM、CaMKK和CaMKIV。神經細胞過多的Ca2＋與CaM結合形成Ca2＋-CaM復合物，進而激活下游底物CaMKK，引起CaMKIV的磷酸化。磷酸化的CaMKIV一方面促進鈣依耐性突觸蛋白的磷酸化，導致突觸間囊泡運輸受阻，影響了新的突觸形成，損害了突觸功能；另一方面，CaMKIV過度磷酸化促使Tau蛋白Thr181、Thr231、Ser396等多個位點激活，促進Tau蛋白發生磷酸化。過度磷酸化的Tau蛋白由于不能與微管結合，容易引起自身聚集，進而形成雙股螺旋纖維，最終形成NFTs，導致神經元的死亡[16-17,32-33]。本實驗發現，Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷模型CaM、CaMKK、p-CaMKIV以及p-Tau蛋白的表達均極顯著升高，而金雀異黃酮預處理可明顯減輕Aβ25-35誘導的海馬神經元損傷，降低損傷神經元CaM、CaMKK、p-CaMKIV以及p-Tau蛋白的表達，提示金雀異黃酮可以下調Ca2＋-CaMKIV信號通路，減少Tau蛋白磷酸化。

綜上所述，金雀異黃酮可以減輕Aβ25-35對大鼠海馬神經元的損傷，其機制可能與減少Ca2＋超載、抑制Ca2＋-CaMKIV信號通路、減少tau蛋白磷酸化有關，但其作用機制仍需進一步深入研究，以為未來植物激素防治AD研究提供選擇。