微生物油脂提取工藝研究進展

王維曼 馬凡提 張 軍 李慕梓 李博玲 向 麗 李翔宇

(嘉必優生物技術(武漢)股份有限公司1，武漢 430073)(湖北省營養化學品生物合成工程技術研究中心2，武漢 430223)

微生物油脂，是指由霉菌、酵母菌、細菌和藻類等產油微生物在一定的培養條件下，利用碳源、氮源等在菌體內大量合成并積累的三酰甘油、游離脂肪酸類以及其他脂質[1]。經過篩選和培育的微生物能產出富含α-亞麻酸(ALA)、γ-亞麻酸 (GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)，和二十二碳六烯酸(DHA)等的功能性油脂。這些功能性油脂，大多是人體必需而又無法自身合成的。ALA、DHA、EPA等ω-3脂肪酸作為人體重要的生命活性物質，能有效促進人體生長發育，具有預防糖尿病、心腦血管疾病，抗癌、抗炎、降血脂，增強機體免疫力等重要的生理功能[2]。隨著人們生活水平的提高，消費者飲食中的ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸比例出現了極大的不均衡。研究發現，長期缺乏ω-3脂肪酸易導致遺傳性肥胖、機體代謝紊亂，進而影響人體健康[3]。ALA可從部分植物油中獲得，DHA和EPA主要來源于魚油和微生物油脂。但魚油成本高、易受污染、品質不穩定、產量難以滿足全球需求。隨著全球人口增長、健康意識的提高，功能性油脂缺乏的矛盾更加突出，微生物油脂的優勢將日益凸顯。

據Coherent Market Insights預計，2018年全球ARA和藻油DHA市場容量為4.47億美元，2026年將增長至12.26億美元。微生物油脂的生產包括菌種篩選、滅菌發酵、菌體預處理、油脂提取、油脂精煉等環節。在工業生產規模上，一般采用傳統的溶劑浸出法提取微生物油脂。本文綜述了微生物菌體預處理和油脂提取方法，為微生物油脂深入研究及開發利用提供一定的參考。

1 微生物菌體預處理

微生物油脂屬于胞內產物，需借助外力破壞細胞壁及細胞膜、使細胞內容物包括目的產物釋放出來，再進行油脂提取[2]。不同種類微生物的細胞結構不同，細胞壁組成、厚度各有差異，需要根據微生物特性選擇合適的預處理方式。預處理方法有物理法、化學法、酶解法等，可單獨使用或聯合使用。

1.1 物理法

1.1.1 傳統物理法

傳統物理法有研磨法、擠壓膨化法、反復凍融法、滲壓震擾法等。這類方法使用剪切、擠壓等機械外力作用于菌體或利用細胞膜的滲透性使細胞破裂，處理效果取決于細胞大小和形狀、細胞壁的結構及機械強度。傳統物理法發展成熟，近年來使用傳統物理法對微生物菌體進行預處理的研究較多，總結如下表1。傳統物理法處理對象多為酵母、藻類等微生物，不同方法的處理時間、溫度、菌體濃度等均影響細胞破壁效果，進而影響油脂提取率。擠壓膨化法在植物油脂提取中應用較成熟，在微生物油脂中研究應用較少，擠壓膨化過程會升溫而影響油脂品質。研磨法、反復凍融法、滲壓震擾法，所需設備簡單、成本低、操作簡便，但破壁效率較低[4]。綜合考慮經濟性、簡潔性，此類方法適用于細胞壁較脆弱的菌體。

表1 微生物菌體傳統物理法預處理提取工藝

1.1.2 現代物理法

隨著物理技術的發展和設備的開發，超聲、微波、脈沖電場、高壓均質等技術與設備逐漸應用于預處理中，總結如下表2。此類方法可用于霉菌、酵母菌、藻類等的預處理，作用于細胞的超聲波、微波、脈沖、壓力等的強度，處理時間，菌體濃度，循環次數是影響細胞破裂程度的重要因素。超聲法方法簡單、重復性較好，在工業化應用中需注意因超聲產生熱量而影響油脂品質、還需解決生產過程中噪聲問題。微波具有高穿透性、高選擇性等特點，微波法操作簡便、處理時間短、效率高，實際應用過程中需關注微波場的不均勻性問題[12，13]。脈沖電場法可連續處理、預處理時間較短，無加熱、能耗低、對油脂品質影響小，破壁效率較高[14]。高壓均質技術安全、簡單、大規模破碎時效果較好；對于細胞壁較厚、難以破碎的、濃度高的或正處于生長期的細胞，通常需多次循環均質[2]；均質時菌體濃度不能過高、產生大量廢水，處理如絲狀真菌時易堵塞設備，應用于大規模工業化生產時儀器費用較高。現代物理法為微生物細胞破壁提供了新思路，需針對不同微生物細胞特性優選合適方法。

表2 微生物菌體現代物理法預處理提取工藝

1.2 化學法

化學法通過酸、堿、表面活性劑等的作用，改變細胞壁或膜的通透性，使細胞內含物滲漏出來[23]。常用化學法有酸熱預處理法、表面活性劑法、亞臨界水解法等。酸熱法利用強酸對細胞壁中糖及蛋白質等成分的作用，使原來結構緊密的細胞壁變得疏松，再經沸水浴及速凍處理，使細胞壁進一步被破壞[4]。表面活性劑可促使細胞某些組分溶解，有助于細胞的破碎[24]。水的離子生成物在亞臨界范圍內相對較高，可以有效加速酸或堿催化的反應；相當數量的生物量(蛋白質和多糖)水解成水溶性化合物、從而使細胞壁水解；此外磷脂被水解成游離脂肪酸，乳化性能降低，改善脂質提取過程中的傳質[25]。

Wang等[26]以甲酸為基礎輔以少量鹽酸處理含水微藻，提取油脂。在甲酸用量5.57 g/g(按微藻干重計，下同)、鹽酸用量0.1 g/g、液固比10∶1、溫度100 ℃的最佳條件下，油脂總收率和脂肪酸甲酯收率分別達到45.6%和85.8%。已有報道利用十四烷基三甲基溴化銨、3-(癸二甲基胺)-丙磺酸鹽內酯、N-十二烷基肌氨酸、十二烷基硫酸鈉等表面活性劑用于微生物細胞破壁[24]。Yellapu等[27]將N-十二烷基肌氨酸用于濕酵母細胞破壁提油，能縮短油脂提取時間，且對脂肪酸組成無影響。Moumita等[28]將亞臨界水萃取技術應用于微藻中，從藻類生物質中同時生產高附加值的多糖和微生物油脂。化學破壁法所需條件簡單，作用直接，適用于大部分微生物細胞破壁，將是一種有前途的工業規模微生物脂質回收方法。但需評估化學試劑對設備、環境、油脂品質等的影響。

1.3 酶解法

酶解法利用酶作用于特定底物，破壞細胞壁結構，降解油脂與蛋白質等的結合，使油脂釋放[29]。常用的外源性酶主要有溶菌酶、纖維素酶、蛋白酶、酯酶、糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等；內源性酶解通過控制溫度、pH、時間、緩沖液濃度及添加激活劑等使細胞發生自溶[30-32]。

You等[30]采用酶法輔助提取高山被孢霉中油脂，果膠酶與木瓜蛋白酶(5∶3)、果膠酶與堿性蛋白酶(5∶1)混合酶解時油脂收率較好，酶解時間是影響酶解效果的重要參數。Zhang等[31]以纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶輔助提取柵藻中脂質。在最佳條件下，油脂提取率較對照組增加了2倍。掃描電鏡、紅外光譜、X射線光電子能譜和高效液相色譜分析結果均表明，酶預處理使微藻細胞壁結構發生明顯改變。酶解法適用于多種微生物細胞的破碎預處理、專一性高，針對不同的細胞壁結構和化學組成，需選擇不同的酶及添加次序。商業化酶價格高、存在產物抑制作用。但是酶解法反應條件溫和、細胞壁損壞程度可控、能耗低、能有效保持油脂品質。酶解法在大規模生產中極具潛力。

2 微生物油脂提取

微生物細胞經預處理破壁后，需要采用合適的方法對油脂進行提取。主要方法有溶劑萃取法、臨界流體萃取法、吸油材料吸附法等。

2.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法利用油脂與待分離混合物在各溶劑中溶解性不同，將油脂提取出來[33]。正己烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑，已被廣泛用于微生物油脂的提取。除了使用單一溶劑外，一些雙相共沸混合溶劑已被證明能有效進行脂質提取[34]。主要有乙醇-正己烷、氯仿-甲醇、氯仿-甲醇-正丁醇-水-EDTA、乙醇-乙醚等[35，36]。混合溶劑中的醇類破壞了靜電力、膜脂與相關蛋白之間的氫鍵，然后非極性組分進入細胞，進行中性脂質提取[34]。

工業生產中常使用正己烷作為萃取溶劑，溶劑萃取前通常需經過干燥處理。Zhu等[35]從高山被孢霉濕菌體和干菌體中分別提取油脂。以氯仿/甲醇/水(2/2/1.8)為溶劑，直接從濕菌體中提取油脂，脂類收率為27.6%；以氯仿/甲醇(2/1)為溶劑，從干物質中提取油脂，脂類收率為41.1%。實驗室常用乙醚等溶劑通過索氏抽提裝置反復萃取菌體中油脂，此方法適合小批量油脂提取及含量檢測。此法將菌體中脂肪、磷脂、固醇等同時提出，使測得油脂含量偏高[37]。溶劑萃取法需要使用大量溶劑，對環境有一定影響，溶劑回收時消耗大量能量，提取的毛油中含有雜質需進一步精煉處理；但其處理量大，油脂提取率高，生產成本低，生產工藝及設備成熟，是工業化生產中最常用的油脂提取方法。

2.2 臨界流體萃取法

臨界流體萃取法以臨界流體為萃取劑，利用壓力、溫度對臨界流體溶解能力的影響，通過控制條件使待分離組分萃取出來，再通過減壓蒸發過程將油脂與臨界流體分離，使被萃取物質析出，達到分離提取效果[38]。根據臨界狀態可分為亞臨界流體萃取和超臨界流體萃取。常用的亞臨界流體有丙烷、丁烷、二甲醚、液化石油氣等，這類物質以亞臨界狀態存在時，分子的擴散性能增加，傳質速度加快，其滲透能力和溶解能力顯著增強[2]。常用的超臨界流體萃取使用CO2為萃取劑，在萃取強極性化合物時，可使用如甲醇、乙醇、己烷等夾帶劑輔助超臨界萃取[39]。

二甲醚亞臨界萃取較傳統溶劑提取具有優越性，其不破壞細胞、對環境友好，可直接用于濕菌體中脂質提取[40]。Catchpole等[41]以二甲醚(DME)為萃取溶劑，對發酵生產的濕生物質和干生物質油脂進行了萃取，使用DME從濕菌體中直接提取脂質，不需要進行烘干。Sallet等[42]利用超臨界CO2(SFE-CO2)和液化石油氣(LPG)萃取深黃被孢霉中油脂。從動力學曲線、傳質速率和萃取物得率來看，80 ℃/250 bar (SFE-CO2)和40 ℃/20 bar (LPG)是最適宜的條件，其中液化石油氣萃取時收率最高，為4.45 wt.%；根據脂肪酸組成來看，SFE-CO2的性能略高于壓縮液化石油氣。李麗娜[43]通過超臨界CO2萃取深黃被孢霉中花生四烯酸。得到最佳萃取條件為：萃取溫度32 ℃、萃取壓力16 MPa、萃取時間100 min和10%甲醇做夾帶劑，花生四烯酸提取率為45.7%，花生四烯酸含量為19.34%。Patil等[44]采用微波預處理、超臨界CO2從微擬球藻中萃取油脂。在優化條件下：混合溶劑(正己烷∶乙醇，1∶1)與藻類比率12∶1、萃取壓力360 bar、萃取溫度80 ℃、超臨界CO2萃取60 min，油脂產量為31.37%(以干基計)，EPA含量在20%～32%之間。

臨界流體萃取技術作為新一代化工分離技術，可在常溫下操作，油脂中的活性成分不易損失，所提取的油脂中雜質少、純度高、品質好[42]。其中超臨界流體萃取不使用有機溶劑、無溶劑殘留、安全性較高，該法較適合于生理活性物質的提取、分離[45]。亞臨界流體來源廣泛、溶劑消耗量小，設備投資成本及生產運行成本較超臨界流體萃取低[2]，更易于工業化應用，在微生物油脂提取中極具發展前途。

2.3 吸附法

吸附法通過具有超疏水性或超疏油性的材料，選擇性吸附油相或水相，達到油水分離的效果。鄭依凡[23]采用聚丙烯-乙烯共聚無紡布作為吸附油脂材料，以物理方法直接對濃縮、高壓勻漿破碎后的粘紅酵母進行油脂提取。吸油材料在聚丙烯原料中加入聚乙烯，提高無紡布的機械強度。無紡布吸油的最佳工藝條件為：150 r/min攪拌、單次吸附時間1 h、溫度60 ℃、材料用量0.5 cm2/mL發酵液、采用二級吸附，油脂總收率達到69.6%。趙一帆等[46]制備超疏水聚丙烯纖維/SiO2氣凝膠復合材料，吸油實驗表明常溫下該復合材料對食用油、汽油、煤油的最大吸附效率分別為6.96、7.54、7.16 g/g。此方法能選擇性吸附油脂、吸附性能良好，操作便捷、常溫即可操作。但現階段油脂收率較溶劑法低、吸附材料制作成本較高，且存在塑化劑污染隱患，暫未應用于微生物油脂工業生產中。

3 展望

微生物油脂具有產率高、安全性好、生產易控制、營養價值高等優勢，深受企業和消費者青睞。隨著市場對食品安全及品質穩定要求越來越高。未來微生物油脂的發展方向可能有：利用現代生物技術繼續探索選育優質菌種；探索資源節約、環境友好型發酵工藝，提高油脂產量；結合不同微生物自身特點持續改進和提高生產工藝，降低成本，向著綠色可持續方向發展；作為功能性原料開發及擴大其在食品、保健品、醫藥等產品中的應用；應用于能源領域緩解能源短缺等。