基于植物電信號的小麥苗期等滲干旱脅迫與鹽脅迫辨識

李進海 李 洋 RICARDO Ferraz de Oliveira 姚杰鵬 黃 嵐 王忠義

(1.中國農業大學信息與電氣工程學院， 北京 100083；2.中國農業大學現代精細農業系統集成研究教育部重點實驗室， 北京 100083；3.中國農業大學農業農村部農業信息獲取技術重點實驗室， 北京 100083；4.圣保羅大學路易斯·德奎羅茲農業學院， 皮拉西卡巴 3538709)

0 引言

干旱脅迫與鹽脅迫是植物在生長發育過程中兩種常見的非生物脅迫，是導致作物減產的重要原因，嚴重威脅著糧食安全[1-2]。干旱造成的高滲透脅迫會導致植物細胞脫水、胞內膨壓降低，從而破壞植物體內的水分平衡。長時間的干旱脅迫會進一步產生次級脅迫，導致植物代謝發生紊亂，使細胞膜的選擇透性發生改變、無機鹽離子與各類小分子外滲[3-5]。如果不能及時緩解干旱，則細胞會發生自溶，甚至在質膜和液泡膜上產生機械破裂，最終導致植物死亡。鹽脅迫又被稱為鹽害，是由于土壤中鹽分過多而產生的一種常見逆境脅迫，可分為原初鹽害和次生鹽害[1]。原初鹽害破壞植物細胞質膜的選擇透性，擾亂細胞正常代謝，使大量的K+和有機溶質外流，同時大量毒害離子進入胞質，產生離子毒害；次生鹽害則進一步導致細胞水分虧缺，產生生理干旱，從而抑制作物生長[6-8]。干旱脅迫與鹽脅迫都屬于逆境脅迫，如果逆境脅迫在作物感知的早期階段能被及時解除，則脅迫產生的傷害是可逆的，若脅迫繼續持續，則對植物細胞的膜系統產生不可逆的傷害，導致作物減產，甚至絕收。因此，在逆境脅迫的早期，準確辨識脅迫、進而采取相應的補救措施對保障作物的生長至關重要。由于干旱脅迫與鹽脅迫均會引發滲透脅迫，使植物不能獲得充足的水分，導致植物莖葉出現萎蔫等相似的形態變化，這種變化除了采用生理生化方法外，很難用直觀的方法進行區分[9-10]。因此有必要探索一種簡單有效的干旱脅迫與鹽脅迫辨識方法。

鑒于此，本文結合支持向量機在小樣本下良好的分類推廣能力[11-14]，提出一種基于植物電信號的干旱脅迫與鹽脅迫辨識方法,以期在脅迫出現的早期實現對這2種脅迫的準確辨識，降低干旱脅迫與鹽脅迫對農作物產量和品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料選擇與培養

實驗樣品采用京411品種的小麥(中國農業大學農學院提供)。挑選顆粒飽滿的小麥種子浸入0.5%次氯酸鈉溶液中消毒30 min，隨后用去離子水沖洗干凈。將處理后的小麥種子放入去離子水中，并在暗處浸種12 h。挑選萌發一致的種子置于帶有發芽紙的培養皿中，以10 mL去離子水浸濕發芽紙，隨后放入人工氣候培養箱中培養。光照/黑暗(光/暗)周期為14 h/10 h，溫度25℃，相對濕度60%。每日添加去離子水，防止發芽紙干涸，4～5 d后可將小麥幼苗用于實驗。

1.2 等滲干旱脅迫與鹽脅迫處理

本文使用甘露醇溶液和NaCl溶液處理小麥幼苗根部，用以模擬植物在生長過程中遇到的干旱脅迫和鹽脅迫。選擇長勢相近的幼苗分為3組，分別設置為對照組、甘露醇(MAN)脅迫(干旱脅迫)組和NaCl脅迫(鹽脅迫)組。為了使小麥幼苗呈現相近的萎蔫狀態，配置滲透勢相同的甘露醇(324 mmol/L，-1.49 MPa)和NaCl溶液(300 mmol/L，-1.49 MPa)。甘露醇溶液的滲透勢計算公式[15]為

ΨMAN=-0.007 8CMANT-2.275CMAN

式中ΨMAN——甘露醇溶液的滲透勢，MPa

CMAN——甘露醇溶液的摩爾濃度，mol/L

T——開氏溫度，25℃時為298.13 K

NaCl溶液的滲透勢按照范托夫公式計算

ΨNaCl=10-6CNaClRT

式中ΨNaCl——NaCl溶液的滲透勢，MPa

CNaCl——NaCl溶液的摩爾濃度，mol/L

R——理想氣體常數，8.314 J/(K·mol)

由于NaCl在溶液中會完全電離成Na+和Cl-，所以NaCl溶液的滲透勢為2倍的ΨNaCl。將培養好的小麥幼苗置于10 mL的小燒杯中，每只燒杯加入5 mL的甘露醇或NaCl溶液脅迫小麥根部12 h，對照組則繼續使用去離子水培養。對照組設置的目的是為了驗證電信號是否能夠辨識脅迫。

1.3 植物電信號采集

植物電信號的采集采用文獻[16-17]中的方法，通過光/暗循環刺激產生穩定的葉表面電位，前期研究將這種電位稱為光誘導生物電發生(Light-induced bioelectrogenesis，LIB)[18-19]。圖1a為植物電信號測量盒。測量盒分為相互獨立的4室，在嵌有Ag/AgCl電極(圖1a中Ei)的盒蓋與盒底分別加入瓊脂凝膠用作葉表面電位的記錄電極。記錄電極的制備方法為：用磁力攪拌器攪拌并加熱瓊脂溶液(50 mL；0.5%瓊脂和10 mmol/L KCl)，直到瓊脂溶液沸騰。隨后分別在每個獨立室的盒蓋與盒底加入15 mL沸騰后的瓊脂溶液，盒蓋與盒底處的Ag/AgCl電極完全浸入瓊脂溶液中。當瓊脂溶液凝固為瓊脂凝膠后，即完成了記錄電極的制備。埋入式Ag/AgCl電極連接信號采集系統(RM6240BD型，成都儀器廠)，記錄電極(Ei+)和參比電極(Ei-)則分別連接到采集系統探頭的輸入端和接地端。由于植物電信號屬于微弱信號，需要在探頭與采集系統間連接高輸入阻抗放大器(SWF-1B型，成都儀器廠)才能有效測量。使用鹵鎢燈(MHAA-100W型，MORITEX，日本)作為刺激光源，光源放置在法拉第屏蔽網外。鵝頸式光纖(A08400型，MORITEX，日本)穿過屏蔽網，光纖的一端位于記錄電極上方10 cm處。該方法可同時采集4株小麥幼苗的葉表面電位。光/暗刺激的循環周期為20 min(光、暗各10 min)，光通量密度為240 μmol/(m2·s)。由于植物電信號相較于動物信號而言屬于慢變信號，因此采用直流模式采集[20]。圖1b為不同脅迫模式下采集到的單周期小麥葉表面電位，用于干旱脅迫與鹽脅迫的早期識別。

2 數據處理與方法實現

2.1 波形選擇

光/暗循環刺激產生的植物葉表面電位在波形上具有很好的重復性，但在刺激開始的早期，波形的規律性變化尚不十分明顯，需要經過2～3個完整周期后才能達到穩定，因此本文選取第4個完整的光/暗周期的波形用于等滲條件下的干旱脅迫與鹽脅迫的識別(圖2)。

2.2 數據預處理

數據提取時，間隔2 s取一點，20 min共計588個點(計時器存在誤差，實際時間略短于20 min)。由于參考電位、接觸電位和植株個體差異的影響，不同樣本表面電位的基線值并不相同，因此在分類前需要對采集的數據進行去基線處理，同時為了使分類模型加速收斂，分別對每個樣本數據進行歸一化處理。歸一化公式為

(1)

式中Xnew——歸一化值

X——原始信號幅值

Xmax——原始信號最大幅值

Xmin——原始信號最小幅值

每個信號樣本包含588數據點，每個數據點作為一個特征。

2.3 基于一對一分類策略的支持向量機

SVM算法最初被廣泛應用于二值分類問題，后被推廣到有M個類的分類問題。處理M類分類問題時，需要構造一系列多類分類機。OVOSVM即是在每2個類之間都構造一個二類分類SVM[21-22]。對于一個M類多分類問題，可得

(2)

式中t——第i類和第j類數據并集中樣本的索引

φ——輸入空間到特征空間的非線性映射

C——懲罰參數

ω——分類超平面法方向

b——偏置

ξ——引入的松弛變量

xt——第t個樣本

對于第i類和第j類數據，i,j∈{1,2，…,M},i

3 結果與討論

3.1 光/暗刺激誘導的植物葉表面電位及其特征

光/暗循環刺激下出現的植物葉表面電位在幅值上的波動，是葉片與記錄電極接觸處的群體細胞(葉肉細胞、表皮細胞和保衛細胞)膜電位在時空變化時疊加的結果，而非單一某種細胞的單獨作用。因此，光/暗誘導葉表面電位的波形形狀不同于強光刺激下任一類型細胞膜電位的變化，其波形幅值低于光刺激下單個葉肉細胞產生的膜電位的振幅[23]。這可能是由于在相同的光照條件下，不同種類細胞表現出不同的極化狀態或極化幅度造成的。葉肉細胞和表皮細胞的質膜在強光刺激下去極化，而保衛細胞的質膜則表現為超極化，這使得群體細胞膜變化的疊加態在時空變化時的幅值存在相互抵消的情況。光誘導產生的植物葉表面電位的波形與幅值主要與光通量密度、光質和光/暗周期3個因素有關[24]。光通量密度主要影響波形的幅度，在一定范圍內光通量密度與幅值成正比，光通量密度越大，波形的峰峰值越大，但當光通量密度達到一定數值時，波形不再有明顯變化。對于小麥,220 μmol/(m2·s)左右的光通量密度即可使波形的變化幅度趨于穩定。光誘導植物葉表面電位與光質密切相關，其對綠光的敏感性最低，而藍光誘導的波形變化則接近全光譜時的波形，由于藍光對葉肉細胞的刺激性最強[25-26]，因此在光誘導產生的植物葉表面電位中，葉肉細胞對電位變化的貢獻度最大。光/暗周期的長短設置對波形的變化趨勢影響很大，光/暗周期選擇的依據是有足夠的時長使電位變化趨于恒定。如圖3所示，不同脅迫下，以10 min/10 min為周期的光/暗循環刺激均可使波形達到峰值后進入相對穩定的變化狀態。但不同脅迫下光誘導植物電信號的峰值幅度以及波形進入峰值的所需時間不同(表1)，這些差異化的特征，可以用于辨識不同類型的脅迫。在此基礎上，為了提高分類的準確性，每個波形樣本的所有數據點均作為特征點。

表1 不同脅迫下光誘導葉表面電位的峰值及達到峰值所需時間

3.2 多維特征的OVOSVM分類

采用多分類支持向量機對正常條件下的樣本以及等滲干旱脅迫和鹽脅迫條件下的樣本進行分類，隨機劃分樣本的訓練集與測試集，對所建立的模型，采取網格搜索法對懲罰因子C與高斯核γ進行參數選擇。為了進一步得到最優參數，實驗均采用三折交叉驗證。另外，在投票之前先對正常樣本與干旱脅迫樣本、正常樣本與鹽脅迫樣本、干旱脅迫樣本與鹽脅迫樣本分別做出預測，用以驗證植物葉表面電位是否可以用于脅迫辨識，隨后對3種樣本進行投票預測。最后經過網格搜索，得到最優參數。實驗結果如表2所示。

表2 分類結果

本課題組曾采用以提取主成分作為特征，選擇波形參數等方法對電信號進行分類，但因為無法利用波形的細節信息導致分類效果受到影響[16]；也曾利用一維卷積神經網絡自動提取波性特征用于分類[17]，這類深度學習的方法需要較多的樣本。因此，以整個波形數據點作為特征進行分類。使用OVOSVM對原始數據進行分類，每個點為一個特征，共計588個特征。3種不同條件下采集的樣本數據在三折交叉驗證后分類準確率為96.30%，網格搜索得到的最優參數C為16，γ為4，標準差為±0.059 3。正常狀態與干旱脅迫以及干旱脅迫與鹽脅迫二分類的準確率均達到100%，正常狀態與鹽脅迫二分類的準確率為94.44%。分類結果表明植物電信號可以用于辨識脅迫，并且可以實現對早期等滲干旱脅迫與鹽脅迫的辨識。

3.3 光誘導葉表面電位辨識等滲干旱脅迫與鹽脅迫的機制

植物在外界刺激下會產生電信號，這種信號是植物對外界刺激的最初響應，攜帶著生理變化產生的信息[27-29]。干旱脅迫與鹽脅迫均會產生滲透脅迫，可以影響細胞膜的離子交換過程，但由于脅迫類型不同，影響離子交換的方式也存在巨大差異。干旱脅迫主要導致大量的無機鹽離子外流，而鹽脅迫則會破壞植物細胞內的Na+/K+平衡，K+大量外流的同時伴隨著大量的Na+和Cl-等毒害離子進入細胞。逆境脅迫導致的細胞在離子交換上的差異，必然會使細胞膜電位產生不同的變化。葉表面電位為測試電極與葉片接觸處群體細胞膜電位在空間上的疊加，脅迫導致的膜電位變化，宏觀上表現為植物對光響應時的敏感性出現差異[23]。相較于膜電位的獲取困難，葉表面電位獲取相對簡單，因此可以通過獲取葉表面電位的方法達到辨識早期干旱脅迫與鹽脅迫的目的。這種差異在逆境脅迫的早期階段就可以得到驗證，既不需要對形態表型進行長期評估，也不需要使用復雜的生理生化方法進行測量。即使是對于干旱脅迫與鹽脅迫這種可導致植物外觀形態上出現相似變化的逆境脅迫，辨識的效果也很明顯。

4 結論

(1)提出了一種基于植物電信號的逆境脅迫辨識方法，該方法可在不使用生理生化方法驗證的前提下準確辨識脅迫，方法簡單有效。

(2)通過光/暗誘導獲取的穩定植物葉表面電位，結合支持向量機在小樣本下良好的分類推廣能力，實現了等滲條件下干旱脅迫與鹽脅迫的辨識，本研究可為作物的抗逆與育種研究提供一種新的手段。

(3)植物電信號攜帶豐富的生理信息，是植物與外界環境信息交流的重要途徑，本研究作為植物電信號實際應用范例，可進一步促進植物電信號解譯工作的開展。