蘋果果實大小相關的ARF-Aux/IAA互作組合篩選

周喆，卞書迅，張恒濤，張瑞萍，高啟明，劉珍珍，閻振立

蘋果果實大小相關的ARF-Aux/IAA互作組合篩選

周喆，卞書迅，張恒濤，張瑞萍，高啟明，劉珍珍，閻振立

中國農業科學院鄭州果樹研究所，鄭州 459000

【】通過轉錄組學和生物信息學，在蘋果全基因組中對可能互作的MdARF和MdIAA進行鑒定，為明確相關基因功能和解析生長素調控蘋果果實大小的分子機理奠定基礎。對野生大果型‘皇家嘎啦’和過表達的轉基因小果型‘皇家嘎啦’進行不同發育時期和不同組織材料的轉錄組測序，對測序結果進行基因的功能注釋及差異表達分析。利用轉基因小果和野生型大果的轉錄組數據，篩選在果實發育中表達的蘋果MdARFs和MdIAAs基因家族成員，通過逐一在兩個家族間計算基因時空表達的相關系數，篩選可能互作的MdARF-MdIAA組合，將從擬南芥基因組中下載的23個ARFs和34個Aux/IAAs、番茄基因組中下載的21個ARFs和25個Aux/IAAs，分別與互作候選MdARFs和MdIAAs進行比對，并進一步構建系統發育樹。使用MEME和TBtools對蘋果候選互作對中的MdARFs和MdIAAs蛋白進行Motif分析。利用STRING蛋白互作預測數據庫進行同源映射，構建蘋果中的蛋白-蛋白互作網絡，進一步的確認候選互作對，最終得到蘋果中通過互作參與果實發育可能性最高的MdARF-MdIAA組合。分別對野生型‘皇家嘎啦’和miR172OX轉基因‘皇家嘎啦’盛花期后兩周的全果和盛花期后4周的果皮、果肉和果核進行轉錄組測序，共生成178.19 Gb的數據量，各項指標均表明，3個生物學重復在所有組織類型上均具有高度一致性。在轉錄組數據中，共鑒定到38個和27個在至少一個文庫中的FPKM值大于2，在蘋果果實發育時期表達。通過計算Pearson相關系數對表達的MdARFs和MdIAAs兩兩進行相關性分析，其中8對MdARF-MdIAA的相關系數大于0.9或小于-0.9，作為初步篩選的候選互作組合。將8對組合中的MdARFs和MdIAAs分別與擬南芥和番茄中的ARFs和IAAs進行序列比對并構建系統進化樹后發現，MdARF6和MdARF19與起轉錄激活作用的AtARFs同屬一個分支。而MdARF2、MdARF4和MdARF9則與起轉錄抑制作用的AtARFs具有較近的親緣關系。Motif分析結果顯示，候選MdARF、MdIAA蛋白中均包含Motif 2和Motif 5。Motif 2和Motif 5分別對應IAA蛋白中的保守結構域Motif IV和Motif III。互作蛋白在擬南芥中進行同源映射校驗后，最終得到兩對MdARF-MdIAA組合可用于進一步的功能驗證。蘋果MdARF和MdIAA家族成員，在果實發育時期，有8對組合在表達量上存在顯著的相關性，進一步同源映射確認互作后，最終確定MdARF4-MdIAA17和MdARF4-MdIAA19兩對互作組合，極有可能通過互作傳遞生長素信號參與調控蘋果果實發育。

蘋果；ARF；Aux/IAA；互作篩選

0 引言

【研究意義】蘋果（×）是世界范圍內栽培最為廣泛的果樹之一。蘋果果實的大小是衡量其品質和商品價值的重要指標。果實的最終大小，主要由果實內細胞數量和細胞大小共同決定[1-2]。植物激素作為協調細胞增殖和細胞膨大的關鍵因子，對蘋果果實生長有著至關重要的影響[3-5]。在眾多參與調節果實大小的植物激素中，生長素（auxin）起著非常關鍵的作用[6]。在果實發育時期，其內部生長素信號的傳遞，主要是通過生長素響應因子（auxin response factor，ARF）和生長素/吲哚乙酸蛋白（Auxin/Indole-3-Acetic Acid，Aux/IAA）之間的相互作用完成[7-8]。目前，相關的ARF和Aux/IAA互作鑒定主要集中在模式植物中，且ARF和Aux/IAA互作關系在調控果實發育中的研究鮮有報道。【前人研究進展】生長素在植物中廣泛存在，參與植物器官發育、脅迫響應、果實成熟等各類生物學過程[9]。對植物施用外源生長素，極短的時間內即可觀察到、（Gretchen Hagen3）、（Small Auxin Up RNA）等一系列生長素相關基因的表達水平發生改變[3,10-11]。ARF和Aux/IAA作為兩個功能上相關的基因家族，是感應植物體內生長素濃度變化的核心元件[12]。兩者通過互作形成復合體，將接收到的信號以促進或抑制上下游相關基因表達的形式釋放，最終引起植物形態發育上的差異[13]。ARF與Aux/IAA調控生長素信號轉導的模式為，當植物體內的生長素濃度處于較低水平時，Aux/IAA蛋白與ARF蛋白結合，阻止ARF激活生長素相關基因的轉錄；當生長素濃度上升時，Aux/IAA與生長素受體TIR結合并被降解，釋放ARF來調控相關生長素響應基因的表達[13-14]。ARF家族蛋白在結構上主要包含一個N端B3型DNA綁定結構域（DNA binding domain，DBD）、一個C端的二聚綁定下游生長素響應基因的結構域（dimerization domain，CTD）和一個非保守的中間區域（middle region，MR）。Aux/IAA家族蛋白包含I、II、III、IV四個保守結構域，其中結構域I是一個起阻遏作用的富亮氨酸重復結構域（LxLxL），結構域II可以與生長素受體TIR1（Transport Inhibitor Resistant 1）結合引起Aux/IAA的泛素化降解，結構域III、IV是與ARF的CTD同源的結構域，參與Aux/IAA與ARF的二聚化[15-19]。Aux/IAA和ARF蛋白都是在轉錄水平對下游基因進行調控。Aux/IAA家族成員通常對下游生長素相關基因的表達起抑制作用，而ARF蛋白主要通過DBD結構域識別下游基因啟動子區域的生長素響應元件（AuxREs）來調控其表達，調控作用取決于其MR的氨基酸序列[14]。起轉錄激活作用的ARF，其MR富含谷氨酰胺、亮氨酸和絲氨酸殘基，例如擬南芥的ARF5、6、7、8、19[12]；而阻遏轉錄活性的ARF，其MR則富含谷氨酸、亮氨酸、絲氨酸和脯氨酸殘基，例如擬南芥AtARF1、2、4、9[20]。到目前為止，已有15種植物的ARF基因家族（包括蘋果）和30種植物的Aux/IAA基因家族通過全基因組分析得到了鑒定。而全基因組范圍內對兩個基因家族間互作可能性的鑒定主要集中在擬南芥、番茄和水稻中[20]。其中擬南芥中共鑒定到213對可能的互作關系，在番茄的21個ARF和24個Aux/IAA之間進行了互作篩選，水稻中的8個ARF和15個Aux/IAA之間可能存在相互作用[8,21-22]。擬南芥中的ARF-Aux/ IAA互作復合體主要在子葉下胚軸和根部發育中起作用；番茄中的SlARF5-SlIAA3、SlARF7A-SlIAA8和SlARF4-SlIAA15可能通過互作調控果實發育[22-25]。在蘋果中，MdARF13可以與MdIAA121互作，生長素可以通過MdARF13- MdIAA121介導的信號路徑調控花青苷合成[26]。【本研究切入點】蘋果中全基因組范圍內ARF和Aux/IAA互作篩選尚未開展，且ARF和Aux/IAA的互作在果實發育中扮演的角色尚未可知。【擬解決的關鍵問題】課題組前期通過在‘皇家嘎啦’中過表達miRNA172p獲得了果實顯著變小的轉基因蘋果（miR172OX）[27]。通過對miR172OX和野生型的‘皇家嘎啦’（WT）不同發育時期的果實和組織進行轉錄組測序，發現ARF和Aux/IAA家族的基因表達量變化差異顯著且存在相關關系。本研究擬通過對轉錄組中鑒定到的ARF和Aux/IAA進行成對表達分析，篩選到可能存在的果實發育過程中的互作組合。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年于中國農業科學院鄭州果樹研究所進行。

1.1 試驗材料

本試驗選擇野生型‘皇家嘎啦’（WT）和:轉基因‘皇家嘎啦’（miR172OX）兩個基因型的蘋果進行轉錄組測序。兩個基因型的蘋果均定植在新西蘭植物和食品研究所。分別選取盛花后2周的全果（WF）和盛花后3周果實的果皮（FS）、果肉（FF）和果核（FC），每個樣品3個重復，共24個樣品。取樣后液氮速凍并于-80℃保存。

1.2 總RNA提取、文庫構建及測序

參照Zhou等[28]的方法提取樣品總RNA。得到總RNA后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品RNA的完整性及是否存在DNA污染。使用NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒對總量大于1 μg的總RNA進行文庫構建。通過Illumina Hiseq測序平臺對制備的文庫進行測序，并產生150 bp配對末端讀數。測序的原始數據已上傳到NCBI，SRA登錄號為PRJNA649660。

1.3 基因的功能注釋及差異表達分析

以GDDH13 v1.1為蘋果參考基因組（×）[29]，使用HISAT2 v2.0.5構建參考基因組的索引。使用DESeq2R（1.16.1）軟件進行兩個基因型之間的差異表達分析，如果基因的adj值<0.05，則被認定為差異表達[30]。校正后的值以及|log2foldchange|作為顯著差異表達的閾值。差異表達基因在至少一個文庫的FPKM值要大于2以消除低表達的基因。

1.4 蘋果ARF和Aux/IAA家族互作關系預測及系統進化分析

根據從轉錄組數據中鑒定到的和的FPKM值，兩兩基因之間計算表達量的Pearson相關系數。以|PCC|（pearson correlation ecoefficiency）的值大于0.9為篩選標準，得到候選互作基因。從擬南芥數據庫TAIR（http://www.arabiodpsis.org）中下載擬南芥基因組中23個ARFs和34個Aux/IAAs的氨基酸序列，從NCBI上下載番茄基因組中21個ARFs和25個Aux/IAAs，分別與互作候選MdARFs和MdIAAs進行比對并構建系統發育樹。使用MEME和TBtools對蘋果候選互作對中的MdARFs和MdIAAs蛋白進行motif分析。

1.5 蛋白-蛋白互作網絡構建

利用擬南芥STRING數據庫進行蛋白-蛋白互作預測，提取其中包含候選MdARFs和MdIAAs的節點，選擇互作分數大于700的互作蛋白構建蘋果中的互作網絡。

2 結果

2.1 RNA-seq結果的統計分析

在前期研究中，獲得了miRNA172p過表達的轉基因‘皇家嘎啦’。其果實與野生型果實相比，果個顯著變小[27]（圖1）。選取依賴細胞分裂進行果實增大的盛花期后2周的全果和依賴細胞擴張進行果實膨大的盛花期后4周的果皮、果肉和果核進行轉錄組測序分析。通過Illumina Hiseq 2500 platform，24個庫一共生成178.19 Gb數據量。Q20和Q30的值分別大于97.28%和92.37%。Pearson相關分析（2=0.88—0.98）表明，3個生物學重復在所有組織類型上均具有高度一致性。

2.2 蘋果ARF和IAA家族成員的表達圖譜及差異表達基因

根據基因注釋，從轉錄組數據中一共鑒定到38個和27個在果實中表達（圖2-A）。其中分別有17個和14個在WT和miR172OX中的表達量存在差異，為差異表達基因（圖2-B）。在差異表達的17個中，有3個為下調基因，14個為上調基因。而14個差異表達的均為下調基因。

A：成熟果實；B：成熟果實果肉組織切片

A：熱圖顯示蘋果ARF和IAA基因家族表達量的聚類分析；B：蘋果ARF和IAA基因家族中的差異表達基因及差異表達趨勢

2.3 生長素信號路徑中的蛋白互作預測

ARF與Aux/IAA的特定互作組合對不同組織、發育階段和生物學過程中生長素響應的方式起著重要的決定作用[31]。通過將上述38個和27個在不同發育時期和不同組織中的表達量逐對進行相關性分析，共鑒定到8對相關系數大于0.9或小于-0.9的ARF-Aux/IAA候選互作組合，其中包括MdARF19（MD02G1096700）和MdIAA29（MD08G1151300）（0.912），MdARF4（MD03G1116000）和MdIAA14（MD16G1206700）（0.960），MdARF4（MD03G1116000）和MdIAA19（MD17G1198100）（0.968），MdARF16（MD04G1096900）和MdIAA22D（MD10G1193000）（-0.912），MdARF6（MD10G1257900）和MdIAA13（MD15G1169100）（-0.901），MdARF6（MD10G1257900）和MdIAA19（MD17G1198100）（-0.943），MdARF9（MD14G1131900）和MdIAA29（MD08G1151300）（0.926），MdARF2（MD14G1148500）和MdIAA22D（MD10G1193000）（-0.930）（圖3）。8對候選組合中，共包括6個和5個。候選互作對中涉及的11個基因中，除了外，其余均為差異表達基因（圖2-B）。

2.4 候選MdARFs和MdIAAs的系統發育分析

分別將MdARF2、MdARF4、MdARF6、MdARF9、MdARF16、MdARF19和擬南芥（）中的23個AtARFs、番茄中的21個SlARFs，將MdIAA13、MdIAA14、MdIAA19、MdIAA22D、MdIAA29和擬南芥中的34個AtIAAs、番茄中的25個SlIAAs進行序列比對后，構建系統進化樹（圖4-A）。參照與擬南芥ARF家族成員的親緣關系，MdARF6和MdARF19分別與起轉錄激活作用的AtARFs聚類到同一分支；而MdARF2、MdARF4和MdARF9則與起轉錄抑制作用的AtARFs具有較近的親緣關系。Motif分析結果顯示，候選MdARF和MdIAA蛋白中均包含Motif 2和Motif 5。Motif 2和Motif 5分別對應IAA蛋白中的保守結構域Motif IV和Motif III（圖4-B）。

圖3 在時空共表達的ARF和Aux/IAA間鑒定蛋白互作

A：蘋果候選ARF-Aux/IAA互作對中MdARFs和MdIAAs的系統發育分析；B：蘋果候選ARF-Aux/IAA互作對中MdARFs和MdIAAs的保守結構域分析

2.5 蛋白-蛋白互作網絡分析

蛋白-蛋白互作網絡可以預測兩個蛋白間直接的相互作用或間接的功能相關性。在構建的蘋果蛋白-蛋白互作網絡中搜索上述8對候選ARF-Aux/IAA中的11個基因，共有5個基因出現在互作網絡中，包括MdARF4、MdARF19、MdIAA14、MdIAA19和MdIAA29（圖5）。其中候選的MdARF4-MdIAA17和MdARF4- MdIAA19互作對在蛋白-蛋白互作網絡中也顯示互作關系。

3 討論

許多研究表明，ARF和IAA在植物生長和發育等多個方面起作用[32]。本研究鑒定到的和中接近一半的基因在大、小果兩個基因型中表達量存在差異。8對相關性較高的ARF-Aux/IAA 候選組合，其中MdARF19和MdIAA29、MdARF4和MdIAA14、MdARF4和MdIAA19、MdARF9 和MdIAA29呈正相關，而MdARF16和MdIAA22D、MdARF6和MdIAA19、MdARF6和MdIAA13、MdARF2和MdIAA22D呈負相關（圖3）。8對組合中，除MdARF19和MdIAA13不滿足adj<0.05，為非差異表達基因外，組合中其他基因均在一個或多個時期和/或組織中顯示差異表達（圖2-B）。對8對候選組合內成員進行保守結構域分析表明，互作組中所有和編碼的蛋白，在C端均包含同源的保守結構域（CTD結構域或結構域III、IV）（圖4），進一步在結構上證明了8對候選組合互作的可能性。番茄中鑒定到的21個ARF因子中，在果實發育時期呈現高表達的包括、、、、和[33-34]。其中在番茄果實發育初期起負調控作用，而則是番茄果實膨大期重要的負調控因子[35]。可以通過負調控來影響果實中糖分的積累[36]。系統發育結果顯示，候選互作對中的MdARF2與SlARF2、MdARF4與SlARF4、MdARF6與SlARF6、MdARF16與SlARF16、MdARF9與SlARF9分別具有較近的親緣關系（圖4-A），因此，蘋果中的可能與番茄在果實發育中起相似的調控作用。

節點大小對應節點連接數量，節點顏色對應Log2（Foldchange）值，節點間連線顏色對應PCC值

同源映射是一種比較成熟的預測蛋白質間互作的方法，它主要是基于蛋白之間的互作關系伴隨著物種進化而表現出的保守性。本研究最終確定了互作可能性最高的組合為MdARF4-MdIAA17和MdARF4- MdIAA19。除此之外，蛋白-蛋白互作網絡還顯示MdIAA19與TPR3/4（Topless-related）之間的互作關系。TPR是一類保守的植物轉錄輔抑制因子家族蛋白，能夠與Aux/IAA包含的LxLxL類型的EAR基序結合。在植物缺乏生長素刺激時，Aux/IAA蛋白可與TPR形成蛋白復合物，綁定到植物生長素相關基因的啟動子區域，從而抑制ARF轉錄因子，該機制在植物激素應激反應中發揮重要作用[37]。

到目前為止，關于ARF和IAA調控果實發育的研究多集中在番茄，且多以單獨的ARF或Aux/IAA家族成員功能鑒定為主。有關生長素路徑中的ARF- Aux/IAA互作單元如何調控果實大小，尤其是多年生果樹果實大小的分子機理研究非常有限。通過轉錄組測序技術，可以獲得特定組織在特定時期和特定條件下所有基因的表達情況。借助生物信息學等手段，通過數據量化的方式預測功能基因之間完成生物過程的協作關系，可提高調控網絡解析的效率。本研究完成了蘋果全基因組范圍內果實發育相關ARF- Aux/IAA互作對篩選，為進一步深入解析兩個家族基因在生長素路徑中扮演的角色及調控果實發育的作用奠定了基礎，極大地提高了今后通過分子生物學和基因工程手段進行基因功能驗證的效率。

4 結論

本研究共鑒定到8對在表達量上存在顯著相關性的果實發育候選MdARF-MdIAA組合，進一步同源映射確認互作后，最終確定了MdARF4-MdIAA17和MdARF4-MdIAA19兩對互作組合，可用于進一步的功能驗證。

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Screening of ARF-Aux/IAA Interaction Combinations Involved in Apple Fruit Size

ZHOU Zhe, BIAN ShuXun, ZHANG HengTao, ZHANG RuiPing, GAO QiMing, LIU ZhenZhen, YAN ZhenLi

Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 459000

【】The transcriptomics and bioinformatics methods were used to carry out the genome-wide potential interacting MdARFs and MdIAAs pairs screening, so as to build a foundation for clarifying the function of related genes and elucidating the molecular mechanism underlying auxin-regulated apple fruit size.【】Two apple genotypes, Royal Gala (WT) andtransgenic Royal Gala (miR172OX ) were used as test materials in this study. Fruit materials from different developmental stages and tissue types were collected for both genotypes and were subjected to transcriptome sequencing. Clean reads were aligned to the reference genome and the differential expression analysis was performed. Based on the transcriptome data obtained by sequencing the transgenic small fruit and wild-type large fruit, the pairwise expression analysis was performed across MdARFs and MdIAAs families. The amino acid sequences of 23 ARFs and 34 Aux/IAAs were downloaded from Arabidopsis genome, and 21 ARFs and 25 Aux/IAAs were downloaded from tomato genome, which were further compared with candidate MdARFs and MdIAAs to construction phylogenetic trees. The MEME and TBtools were used to carry out the Motif analysis for candidate MdARFs and MdIAAs. Pairs with high interacting possibilities were further confirmed by a protein-protein interacting network constructed in apple to finalize combinations with the highest probability of involvement in fruit development. 【】The whole fruit at 2 weeks post full bloom and the fruit skin, fruit flesh and fruit core at 4 WPFB were collected from WT and miR172OX, respectively. To achieve research objectives, transcriptome sequencing was carried out. A total of 178.19 Gb paired-end reads of 125 bp/150 bp were generated. All indexes indicated that the three biological replicates had highly consistent transcriptome profiles across all tissue types. FPKM values in at least one library was over 2 were used as a standard to eliminate the low expressed genes, so a total of 38and 27were expressed. In our fruit developmental transcriptome data, eight pairs of MdARF-MdIAA were obtained through Pearson correlation analysis, whose Pearson correlation coefficient was over 0.9 or below -0.9. The systematic phylogenetic analysis showed that MdARF6 and MdARF19 belonged to the same branch with AtARFs, which played a role in transcription activation, while MdARF2, MdARF4, and MdARF9 were closely related to transcriptional inhibitory AtARFs. Motif analysis results showed that both the candidate MdARFs and MdIAAs proteins contained Motif 2 and Motif 5, which were corresponded to the conserved domains Motif IV and Motif III in the IAA protein, respectively. After homolog mapping inspection with Arabidopsis, two potential MdARF-MdIAA interacting pairs were selected for future functional identification. 【】Among apple MdARF and MdIAA family members, eight pairs of MdARF-MdIAA showed significant correlations in terms of their expression patterns during fruit development. Further homology mapping confirmed two pairs of them, including MdARF4-MdIAA17 and MdARF4-MdIAA19, were most likely to participate in the regulation of apple fruit development through mediating auxin signal transduction.

apple; ARF; Aux/IAA; interacting-pair screening

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.014

2020-08-30；

2020-10-14

國家重點研發計劃（2018YFD1000106）

周喆，E-mail：zhouzhe@caas.cn。通信作者閻振立，E-mail：yanzhenli@caas.cn

（責任編輯 趙伶俐）