兩種異常核型髓系腫瘤的基因突變及臨床相關性分析

徐啟璐，高 慧，冉學紅，王軍軍，張俊英，劉麗萍，*

(1．濰坊醫學院，山東 濰坊261053；2．濰坊醫學院第一附屬醫院/濰坊市人民醫院血液內科，山東 濰坊261041)

7號染色體丟失或長臂缺失(-7/7q-)是骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中最常見的染色體改變之一，尤其是繼發性MDS和AML。然而1號和7號染色體的不平衡易位形成衍生染色體+1，der(1;7)(p10;q10)[以下簡稱der(1;7)]，導致1號染色體長臂(1q)三體和7號染色體長臂(7q)單體，是髓系腫瘤中一種少見的重現性、獲得性核型異常。自1980年Geraedts首次報道的3例伴der(1;7)核型異常的骨髓纖維化患者以來，至今已報道近300例，國內僅有少數幾篇報道。由于一半以上的患者既往有抗腫瘤化療史(特別是含有烷化劑、拓撲異構酶II抑制劑)和/或放療史，或職業性有毒物質接觸史，因此與繼發性或治療相關的MDS(t-MDS)或AML(t-AML)相關。目前對于der(1;7)的預后仍存在爭議。此外，der(1;7)患者的突變譜與預后生存的關系仍未明確。在本研究中，我們對2013—2020年通過常規細胞遺傳學分析檢出的21例伴有der(1;7)和-7/7q-異常的髓系腫瘤患者進行了二代測序技術(next generation sequencing，NGS)，并探討der(1;7)和-7/7q-患者的實驗室檢查結果、基因突變和臨床轉歸方面的差異。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2013年1月—2020年11月濰坊市人民醫院21例伴有der(1;7)或-7/7q-異常的MDS、AML和骨髓增殖性疾病(myeloproliferative neoplasm，MPN)患者的臨床資料，確認der(1;7)或-7/7q-為唯一的細胞遺傳學異常，排除伴有其他細胞遺傳學改變的患者。將其分為der(1;7)組和-7/7q-組，所有患者均在初診時采集骨髓標本，應用NGS檢測與疾病相關的38個基因突變，分析NGS結果及相關臨床資料。疾病診斷均符合2016年世界衛生組織(World Health Organization，WHO)關于MDS、AML(非M3型)、MPN修訂分型標準。預后危險度分級MDS參照修訂的國際預后評分系統(IPSS-R)，AML參照2017年成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南。療效評價參照修訂的2018年MDS國際預后工作組(IWG-PM)療效標準和2017 ELN的白血病診斷和管理標準。21例患者中有17例應用去甲基化藥物(地西他濱/阿扎胞苷)治療，11例應用蒽環類藥物化療。研究隨訪截至2020年12月25日，中位隨訪時間169 d。

1.2 染色體制備

用常規方法對未經刺激的骨髓液培養(24和48 h)制備的R顯帶中期細胞進行常規染色體分析。對20個中期細胞進行了常規細胞遺傳學分析。核型按照人類細胞基因組學國際命名體系(ISCN2016)報告。部分患者應用熒光原位雜交(fluorescence

in situ

hybridization，FISH)檢測1號及7號染色體長臂。對200個間期細胞進行FISH分析。

1.3 二代測序檢測基因突變

提取骨髓液標本中基因組DNA，制備DNA全基因組文庫。使用聚合酶鏈反應(PCR)引物擴增目的基因組38個MDS/AML/MPN相關基因，將目標區域DNA富集后，采用illumina測序平臺進行二代測序。測序后用dbSNP、1 000 genomes、COSMIC、Polyphen-2、SIFT等數據庫對原始數據進行生物信息學分析，確定致病性基因突變位點。平均測序深度1 000×，變異頻率＞5%的突變位點檢出率＞99%。測序由武漢思泰得醫學檢驗平臺完成。

1.4 統計學處理

采用SPSS 25.0、Prism軟件進行統計分析、作圖；計量資料的組間比較，符合正態分布資料采用單因素方差分析或

t

檢驗，非正態資料使用Kruskal-Wallis

H

檢驗或Mann-Whitney

U

檢驗；計數資料采用卡方檢驗或Fisher精確概率法進行差異性分析，檢驗水 準α＝0.05。以Kaplan-Meier法 計 算 總 生 存 期(overall survival，OS)，OS定義為從開始治療到因任何原因死亡的時間或最后一次隨訪的時間，率的比較采用Log-rank檢驗。應用Spearman等級相關分析患者的核型和突變基因的相關性。

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本特征

本研究共納入21例患者，男性14例，女性7例，中位年齡58(52～64)歲。對21例患者的骨髓中期細胞進行常規染色體分析，應用FISH對其進行突變檢測，結果見圖1，利用缺失擴增探針檢測發現3個1q21，1個D7S522異常熒光信號。患者的臨床特征及實驗室檢查結果見表1，可見21例患者中11例為der(1;7)核型異常患者，10例為-7/7q-核型異常患者，der(1;7)組中MDS 3例，AML 7例，MDS/MPN-MF伴 發 肺 癌1例；-7/7q-組中MDS 5例，AML 5例。der(1;7)患者中以男性為主，男女比例10∶1，-7/7q-患者的男女比例大致均等(2∶3)，差異有統計學意義(

P

=0.024)。der(1;7)組患者的血小板計數(1.5×10個/L)顯著低于-7/7q-組(4.3×10個/L，

P

=0.036)，der(1;7)組患者的C反應蛋白(C reactive protein，CRP)(51.3 mg/L)顯著高于-7/7q-組(8.15 mg/L，

P

=0.029)。將核型異常患者分為MDS與AML亞組，der(1;7)與-7/7q-患者的骨髓原始細胞計數差異無統計學意義(均為

P

＞0.05)。兩組患者的免疫分型具有相似性(

χ

=0.078，

P

=1.000)，共同表達CD38、CD13、HLA-DR、CD117、CD34、CD33。

圖1 骨髓細胞遺傳學檢測結果

表1 der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的臨床特征及實驗室檢查結果

根據WHO(2016)分型，der(1;7)的MDS患者多為MDS-EB1分型；AML多為M5型，-7/7q-多為MDSEB2型；AML各型較分散。預后危險度分層，分析結果見表1，AML患者IPSS-R評分der(1;7)全部表現為中等預后，-7/7q-全部表現為不良預后，兩組差異有統 計 學 意 義(

P

＜0.01)。21例 患 者 中17例[der(1;7)7例，-7/7q-10例]應用去甲基化藥物治療，11例[der(1;7)8例，-7/7q-3例]應用蒽環類藥物化療，MDS患者中7例(87.5%)應用去甲基化藥物治療，AML患者中8例(61.5%)應用去甲基化藥聯合蒽環類藥物化療，der(1;7)組患者的總緩解率(ORR)優于-7/7q-組(

P

=0.131)。

2.2 核型與基因突變的相關性

采用NGS檢測基因突變，21例患者中有6例(28.6%)未檢測到突變，11例der(1;7)患者中有7例(63.6%)檢測到突變，10例-7/7q-患者中有8例(80%)檢測到突變，共檢出13種基因37個突變，4例(23.8%，4/21)攜帶1個突變，11例(52.4%，11/21)攜帶2個(5例)、3個(3例)、4個(1例)或5個(2例)突變。人均檢出(1.76±1.02)個突變患者的突變基因分布見表2。根據基因功能分類，按突變頻率由高到低依次表現為遺傳 相 關 基 因(

DNMT3A

、

IDH1

/

IDH2

、

TET2

、

ASXL1

、

SETBP1

、

EZH2

)(59.5%，22/37)、轉錄調節相關基因(

RUNX1

、

ETV6

、

BCORL1

、

CUX1

)(21.6%，8/37)、信號轉導相關基因(

JAK2

、

CBL

)(10.8%，4/37)、剪接體相關基因(

U2AF

1)(8.1%，3/37)。der(1;7)患者中

RUNX1

(21.4%)、

IDH1/IDH2

(21.4%)、

JAK2

(21.4%)基因突變頻率較高，-7/7q-患者中

SETBP1

(17.4%)、

TET2

(17.4%)、

ASXL1

(13%)、

U2AF1

(13%)、

DNMT3A

(13%)基因突變頻率較高。兩組核型基因組成差異有顯著統計學意義(

P

=0.012)，突變基因類型與核型之間存在正相關(

r

=0.522，

P

=0.001)。分別比較單個基因型在兩種細胞遺傳學中的數量分布，僅

SETBP1

基因突變數量差異有統計學意義(

P

=0.035)。

表2 der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的突變基因分布*

2.3 核型與患者預后生存的相關性

der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的生存曲線見圖2，der(1;7)組患者的中位OS、總OS均較-7/7q-組顯著縮短，差異有統計學意義(

P

=0.045，HR=2.844)，兩組患者死亡風險差異無統計學意義(

P

=1.000)。基因突變型與野生型的核型異常患者生存曲線見圖3，der(1;7)患者中

RUNX1

基因突變型較野生型中位OS明顯縮短(

P

=0.435，HR=1.936)；

IDH1

/

IDH2

(

P

=0.300，HR=0.343)、

JAK2

(

P

=0.487，HR=0.476)突變型較野生型表現出較長的OS；-7/7q-患者中

ASXL1

突變型較野生型中位OS顯著縮短(

P

=0.018，HR=5.583)，

SETBP1

基因表達頻率較der(1;7)患者高，差異有統計學意義(

P

=0.035)。

SETBP1

與

ASXL1

基 因 常 常 伴 隨 出 現(2/10)。

U2AF1

突變型較野生型OS延長(

P

=0.464)，且常與

SETBP1

突變伴發(2/10)。

DNMT3A

(13%)為-7/7q-患者中常見的突變基因，突變型較野生型中位OS縮短(

P

=0.061，HR=5.375)。

TET2

突變在der(1;7)和-7/7q-患者中均有表達，兩者之間差異無統計學意義(

χ

=0.361，OR=0.333)。

圖2 der(1;7)與-7/7q-髓系腫瘤患者的生存曲線

圖3 基因突變型與野生型的核型異常患者生存曲線

3 討論

der(1;7)染色體異常是著絲粒區域內有絲分裂重組的產物，在MDS、AML及MPN中的發生率分別為1%～3%、1%～2%和1%，中位OS為24～46個月，白血病轉化率為14%～52%。本研究患者的臨床特征與既往報道大體一致，der(1;7)組患者男性居多，血小板計數顯著低于-7/7q-組；CRP顯著高于-7/7q-組，與初診時出血、感染發生率高有關。兩組患者的年齡分布相似，WBC、HGB和LDH的計數差異無統計學意義。der(1;7)組的AML較-7/7q-組骨髓原始細胞計數高，但差異無統計學意義。這與既往報道的der(1;7)異常MDS患者具有較低的骨髓原始細胞比例有差別。

der(1;7)和-7/7q-兩種細胞遺傳學組可能具有不同的致病模型，目前已經發現與這種易位相關的一些特異性分子靶點。Westman等在11例合并der(1;7)異常的MDS或AML患者中發現了4例

IDH1

/

IDH2

突變，Hartmann等對80名7q-患者進行NGS確定

ASXL1

、

TET2

、

RUNX1

的高頻突變；而國內陳蘇寧教授團隊對22例der(1;7)患者進行NGS，證明der(1;7)與

RUNX1

的高頻突變有關。本研究通過對21例髓系腫瘤患者進行NGS，發現der(1;7)患者

RUNX1

、

IDH1/IDH2

、

JAK2

基因的突變頻率較高，-7/7q-患者中

SETBP1

、

TET2

、

ASXL1

基因的突變頻率較高，基因與核型存在顯著的相關性，且-7/7q-患者中

ASXL1

與

SETBP1

存在伴隨突變。這與既往報道基本一致，但由于NGS檢測Panel的設計和檢測基因的熱點區域不同，導致結果存在異質性。

RUNX1

突變比例在初診AML和MDS中為10%和10%～20%，本研究

RUNX1

突變比例為21.4%；der(1;7)患者

RUNX1

突變型(

RUNX1

)較野生型(

RUNX1

)OS短，預后不良，是der(1;7)患者獨立的預后危險因素。蔡曉輝等證明了

RUNX1

突變的患者WBC水平、原始細胞百分比及白血病轉化(leukemic transformation，LT)率更高，血小板水平更低。多篇文獻提出伴

RUNX1

突變的年輕患者更能受益于異基因造血干細胞移植(HSCT)。本研究結果顯示

IDH1

/

IDH2

患者相比

IDH1

/

IDH2

OS延長。Xu等基于33篇已發表的研究進行了meta分析，得出在核型異常的AML中

IDH2

突變可延長OS，且與預后良好相關。Westman等也證明了

IDH2

突變的der(1;7)患者預后明顯好于野生型，與LT正相關，但與其他7號染色體異常呈負相關，這表明在白血病發生中有一種不同于其他7號染色體缺陷的特殊生物學效應，可能與1q三體有關。Molenaar等通過實驗證明PARP抑制劑olaparib和talazoparib(奧拉帕利和他拉唑帕尼)與DNA損傷劑(柔紅霉素)的聯合化療對

IDH1

/

IDH2

AML細胞的致死性更高，可能是治療

IDH1

/

IDH2

AML更好的策略。本研究11例應用蒽環類藥物的患者中有9例應用了柔紅霉素為基礎的化療，患者OS延長，與上述研究結論一致，可用于指導治療。此外，

IDH

抑制劑在復發難治性

IDH1

/

IDH2

AML、MDS患者中顯示出良好的前景。

SETBP1

基因在-7/7q-核型異常患者中突變比例高，與

ASXL1

基因常常伴隨出現，且OS縮短。Saika等發現

SETBP1

在

ASXL1

的MDS患者中富集，并與高LT的發生率以及OS縮短有關。

ASXL1

是染色體修飾與調節基因，在MDS、AML、CMML中均與不良預后相關。本研究中

ASXL1

突變主要發生在-7/7q-患者中，OS較野生型顯著縮短，

SETBP1

與

ASXL1

聯合激活

Myc

基因的上調，并抑制了TGF-β信號通路，在體內協同誘導AML，二者聯合突變比單獨出現表現出更強的侵襲性、更高的LT風險和更短的OS。因此

SETBP1

是伴

ASXL1

的MDS的關鍵驅動因素，可作為MDS的潛在治療靶點。組蛋白去乙酰化酶抑制劑伏立諾他(vorinostat)能逆轉這些啟動子區域的組蛋白乙酰化，并誘導TGF-β信號通路的上調。對于

ASXL1

伴

SETBP1

的MDS和AML將是很有前景的治療藥物。

本研究17例患者應用去甲基化藥物治療，11例應用蒽環類藥物化療，der(1;7)組患者的總緩解率(ORR)優于-7/7q-組，但OS不理想，說明der(1;7)患者對單純應用去甲基化及蒽環類藥物有較高的快速緩解率，但由于缺乏進一步的維持治療，der(1;7)組患者的OS顯著縮短。Horio等將13例der(1;7)的MDS患者，基于骨髓發育狀況和骨髓原始細胞計數分為預后良好組及預后不良組，3年生存率為86%和0%。其他幾項研究中兩者的OS差異無統計學意義。本研究中AML病例數量多(7/11)，骨髓原始細胞計數高，有2例由MDS轉化為AML，余5例不能除外先前未診斷且進展迅速的LT的可能性，以及治療相關的基因毒性暴露對治療反應較差、病死率高。既往報道MDS中大多數基因突變導致骨髓原始細胞數升高，預后較差。因此，我們認為AML伴der(1;7)與已知低風險核型異常的AML相比，可能具有不利的臨床特征及預后。Itonaga等對接受HSCT的der(1;7)、-7/7q-和核型正常組患者進行了一項大型的回顧性分析，證明der(1;7)患者在晚期疾病狀態下接受allo-HSCT表現出較好的預后生存。

綜上所述，der(1;7)和-7/7q-核型異常的髓系腫瘤是兩種相互獨立的疾病亞型，二者在實驗室檢查結果、基因突變和臨床轉歸方面存在顯著差異，der(1;7)較-7/7q-患者預后差，OS短，

RUNX1

和

IDH1/IDH2

基因在der(1;7)組中突變頻率較高，

SETBP1

與

ASXL1

基因在-7/7q-組中常常伴隨出現。將基因突變恰當地納入該類疾病預后危險分層中，進行精確的預后風險評估，選擇最佳的治療方案，實施精準個體化診療，將是未來的研究方向。本研究具有一些局限性，分析及包含的患者數量有限，后續需要在大型的隊列研究中進一步證實。