葉酸對阿爾茨海默病的影響及其機制研究進展

李劍飛，郭錫漢，薛京倫，汪 旭，*

(1．云南師范大學生命科學學院，云南 昆明650500；2．復旦大學遺傳學研究所，上海201438)

葉酸(folate)為B族水溶性維生素，作為一碳代謝的一組甲基傳遞體，參與嘌呤、嘧啶合成，以及DNA和各種生物分子甲基化反應。氧化型葉酸經一系列還原過程形成5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-methylenetetrahydrofolate，5,10-MeTHF)，為dUMP轉化為dTMP提供甲基；5,10-MeTHF隨即還原為5-甲基四氫葉酸，為甲硫氨酸(methionine，Met)提供甲基，合成生物體重要甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)，保證DNA精準合成。因此，葉酸攝入及代謝異常與DNA、染色體的結構和功能紊亂息息相關，是發育異常、退行性疾病、腫瘤發生的關鍵風險因子。據報道，帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的發生發展均與葉酸供給和代謝狀態相關。

AD是一種記憶、學習、注意力、人格、空間感等認知功能漸進性破壞乃至喪失的神經退行性病變，其主要組織病理學特征是大腦不溶性淀粉樣蛋白斑塊和細胞內神經纖維纏結的形成與漸進性惡化，二者的核心組分分別是β-淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)和高度磷酸化的微管結合蛋白tau，它們的異常增加是AD發生發展的主要生物學標志。本文圍繞葉酸對Aβ和tau生成過程的生物學作用，綜述葉酸對AD患病風險的影響與可能機制，為AD防范奠定營養干預依據。

1 血清葉酸和同型半胱氨酸水平與AD

多項分子流行病學研究提示，一碳代謝組分中的各種甲基傳遞體、輔酶和相關微營養素與AD的發生發展有著錯綜復雜的聯系，一碳代謝核心組分葉酸的攝入及其代謝狀態與老年人的認知水平變化、AD風險具有顯著關聯。意大利一項以60歲以上、已出現認知障礙的人群為對象的回顧性調查分析，發現血清葉酸含量與認知能力呈正相關，葉酸水平較高(3～4 ng/mL)的個體認知能力顯著高于低葉酸個體(＜2.2 ng/mL)，而一碳代謝中Met合成的底物之一，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的高水平(＞17.68 μmol/L)則與認知障礙的惡化程度正相關。Ma等在病例對照研究中對比了134名中國健康老年人、129名輕度認知障礙患者(mild cognitive impairment，MCI)和131名AD患者的血清葉酸濃度，發現3個群體的葉酸濃度依次降低、與認知狀態呈負相關；該團隊進一步發現Hcy水平與認知障礙惡化正相關，提示高水平Hcy不僅是心血管病的獨立風險因子，其對于神經細胞正常功能也存在負面效應。Hama等根據簡易智力量表(mini-mental state examination，MMSE)評分，在日本45名血清葉酸缺乏(＜3.6 ng/mL)的認知障礙患者中給予葉酸補充干預(5 mg/d，28～63 d)，干預后受試者MMSE評分及輕度認知障礙得到明顯改善，Hcy也在干預后顯著降低。Ravaglia等對平均年齡74歲的816名意大利健康人群隨訪4年，發現112名志愿者發展為MCI，其中70名罹患AD，關聯分析揭示低水平血清葉酸(＜11.8 nmol/L)、高Hcy水平(＞15 μmol/L)個體發展為MCI和AD的風險顯著提高。

多個實驗室利用動物模型開展了葉酸與AD相關病理因素變化的關聯研究。Lawton團隊通過不同劑量葉酸膳食干預12個月，發現無葉酸膳食組的CD-1小鼠較之葉酸添加組(50 μg/d)出現顯著的記憶障礙，海馬區與記憶相關

MafB

和

Zfp410

基因表達顯著下調。Troen等研究人員以無葉酸膳食飼喂大鼠10周，繼而進行認知狀態、血液學和生化分析。發現葉酸缺乏使受試大鼠空間學習與認知功能損害，補充Met可一定程度逆轉這種現象，提示一碳代謝各種組分對認知狀態改變、AD發生的影響具有多樣性和復雜性。Yang等為孕期小鼠補充葉酸(5 mg/kg)，發現仔鼠海馬神經發生較對照得到更好地維護、后代的學習與記憶能力顯著提高。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是平衡一碳代謝中DNA合成與甲基化過程的關鍵酶(圖1)。Bahous團隊用

MTHFR

多態性小鼠模型評價了遺傳變異和營養失衡對葉酸代謝及AD發生發展過程的影響，發現

MTHFR

C677T突變使受試動物短期記憶損傷和焦慮、突觸標志基因轉錄水平異常，葉酸缺乏膳食還誘發甲基供體SAM水平降低，與Aβ加工、神經生長因子、一碳代謝和表觀修飾相關基因如

圖1 一碳代謝途徑示意圖

PS1

、

Ngf

、

Bdnf

、

Hdacs

、

DNMTs

、

Nmda

、

nr1

、

Mat2a

、

Pemt

和

Chdh

均出現轉錄異常。這項研究進一步提示葉酸對于維持正常甲基化、核苷酸和神經遞質合成、良好認知狀態具有重要作用。甲基轉移酶是維護一碳代謝和機體甲基化反應的重要酶系，其成員

DNMT1

和

DNMT3a

均可在神經元中表達。Feng等構建了條件性敲除

DNMT1

或/和

DNMT3a

的小鼠模型，發現雙敲除小鼠海馬神經元體積較對照小、學習記憶缺陷、DNA甲基化程度顯著降低、與突觸可塑性相關的

MHCI

和

Stat1

表達失調，結果提示

DNMT1

和

DNMT3a

是維持DNA甲基化、調節神經元基因表達、維系突觸可塑性與學習記憶必不可少的因素。有研究以質譜法分析了17位過世的AD個體前額葉皮質組織和外周血淋巴細胞12個潛在AD易感基因位點(

APH1B

、

APOE

、

SIN3A

、

BACE

、

HTATIP

、

APP

、

NCSTN

、

TFAM

、

DNMT1

、

MTHFR

、

PSEN1

)的DNA甲基化改變，發現

MTHFR

啟動子區的甲基化水平顯著升高；還有團隊在AD逝者腦組織解剖分析中發現，海馬區細胞的

DNMT1

和

DNMT3a

表達水平顯著下調、全基因組甲基化水平顯著降低，這些結果提示

MTHFR

所控制的DNA合成與甲基化反應，以及甲基轉移酶對甲基化反應的維系功能紊亂均和AD的發生發展有關聯。

2 葉酸對Aβ代謝過程的影響

Aβ的前體為跨膜蛋白APP(amyloid precursor protein)，其降解通常包括淀粉樣和非淀粉樣途徑。在非淀粉樣降解途徑中，APP首先被α-分泌酶切割成N端片段sAPPα和C端片段α-CTF，α-CTF隨后經γ-分泌酶(presenilin 1，PS1)切割形成P3和胞內C端結構域AICD；在淀粉樣降解途徑中，APP經β-分泌酶(BACE1)切割成AICD和sAPPβ，后者被γ-分泌酶進一步分解為Aβ，后續形成含38～43個氨基酸的Aβ(圖2)。Aβ和Aβ是含量最高的Aβ異構體，Aβ具有更強疏水性、聚合性和神經毒性。Aβ的生成和清除過程異常可導致Aβ沉積、形成寡聚體和斑塊，引起海馬區和相關大腦皮層的神經元凋亡、突觸連接喪失，是AD發生的高風險因素。

圖2 淀粉樣蛋白斑和神經纖維纏結形成過程示意圖

BACE1和PS1是降解APP、加工合成不同大小Aβ片段的重要角色。Fuso課題組探索了表觀遺傳修飾對

PS1

和

BACE1

啟動子甲基化與淀粉樣蛋白生成在AD發生發展中的作用與機制，先后在AD小鼠模型中發現高濃度Hcy與低水平B族維生素引起的一碳代謝異常使得轉基因小鼠

PS1

和

BACE1

基因低甲基化、表達上調。Li等研究人員也開展了葉酸對

APP/PS1

轉基因AD小鼠模型Aβ水平影響的探索。他們以葉酸缺乏膳食、葉酸和/或SAM正常膳食飼喂小鼠60 d，發現葉酸強化飼喂(120 μg/kg)使受試動物血清葉酸提高，葉酸缺乏小鼠補充葉酸后，其DNMT活性、

APP

和

PS1

啟動子甲基化程度均不同程度提高。研究均認為葉酸通過提高DNMT酶活性而加強相關基因啟動子甲基化、最終可能介導APP、PS1和Aβ水平的下降。研究人員還以Aβ-葉酸共培養小鼠海馬細胞HT-22，發現Aβ寡聚物降低細胞的DNMT活性、上調

PS1

和

APP

的表達，葉酸則在一定程度上消減Aβ生成聚集誘發的神經毒性；該團隊還為

APP

/

PS1

轉基因AD小鼠模型加強葉酸[600 μg/(kg·d)]，發現

PS1

和

APP

啟動子甲基化水平均得到提升、表達活性降低。然而有報道卻稱，在意大利的120名晚發性AD患者和115名對照的外周血基因組中分析了

PS1

、

BACE1

、

DNMT1

、

DNMT3a

、

DNMT3b

和

MTHFR

基因的甲基化水平，發現上述基因的甲基化情形在病例-對照組間未出現顯著差異。因此，一碳代謝組分變異、甲基轉移酶的活性改變對于不同組織細胞的Aβ生成代謝、AD的影響還需要在不同實驗系統、不同物種和組織中更縝密地深入剖析。MTHFR對于DNA合成與甲基化平衡、SAM合成、Hcy正常水平的維護具有不可替代的作用，

MTHFR

677TT純合突變型導致酶活降低近70%。分子流行病學提示

MTHFR

C677T多態性與晚發性AD患病風險的增高相關。APP的Thr668位點磷酸化強度改變，可使APP分解為sAPPβ及sAPPα的平衡紊亂，嚴重干擾Aβ代謝。Hoffman團隊探索了MTHFR功能缺陷所介導的APP分子Thr668位點磷酸化的改變，研究以正常葉酸和低葉酸膳食飼喂

MTHFR

、

MTHFR

和

MTHFR

小鼠6個月，結果發現低葉酸組中，

MTHFR

和

MTHFR

小鼠蛋白激酶GSK-3β被激活、蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)去甲基化和APP的Thr668位點磷酸化水平上升。

MTHFR

遺傳缺陷、GSK-3活化，PP2A去甲基化和APP的Thr668位點磷酸化可能構成Aβ病理性加工的一條機制鏈條。

MTHFR

多態性與膳食葉酸缺乏的相互作用可能損傷神經系統穩態并增加AD患病風險。研究發現，機體葉酸水平變化可調控特異性miRNAs表達，從而介導其靶基因表達改變，引起相應的健康效應。我們圍繞葉酸缺乏與miR-22-p和miR-149-5p表達的關系、以及2種miRNAs對

MTHFR

的靶向調控開展了大量工作，發現葉酸缺乏可以通過上述2種miRNA的表達改變而介導MTHFR功能紊亂。根據前述討論，不排除葉酸水平的改變可通過miRNA表達而影響AD風險的潛能。目前已有一系列的研究，報道了靶向

PS1

、

APP

和

BACE1

的miRNAs如miR-126-3p、miR-335-5p、miR-4422-5P、miR-188-3p、miR-339-5p、miR-200b-3p、miR-106a-5p等。其 中miR-339-5p、miR-200b-3p、miR-106a-5p和miR-339-5p可以響應葉酸缺乏，靶向并調控

PS1

、

APP

和

BACE1

對Aβ生成與加工過程。Liu等以

APP

/

PS1

轉基因小鼠為研究對象，探討葉酸缺乏和正常膳食對miRNA及其靶基因

APP

和

BACE1

的影響。發現葉酸缺乏下調miR-200b-3p、miR-106a-5p和miR-339-5p表達，從而解除相關miRNAs對

APP

和

BACE1

的表達抑制，促進Aβ生成加工與聚集。在離世的AD患者腦組織中，也發現miR-339-5p水平下降，在離體實驗中抑制miR-339-5p表達后，人膠質母細胞瘤細胞的

BACE1

表達水平上升，提示miRNA響應機體微環境變化并介導AD發生發展的可能性。

3 葉酸對tau代謝過程的影響

tau是由

MAPT

編碼、存在于神經元的一種微管結合蛋白，其與微管蛋白結合，參與微管裝配，對于細胞骨架組裝、神經元微管的動態平衡具有重要作用。正常狀態下，tau具有維持神經突觸結構穩定、神經發生和神經元極性等生理功能，人腦中的tau含多個潛在磷酸化位點，通常2～3個位點可被磷酸化。而在AD患者腦組織內蛋白磷酸酯酶PP2A活性下降，蛋白激酶GSK-3β活性增強，磷酸化-去磷酸化平衡紊亂，導致tau過度磷酸化并與微管脫離、自聚合形成神經纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)。NFT具有神經毒性，可導致神經元功能障礙乃至細胞死亡，是AD的關鍵生物標志之一。Sontag課題組揭示了葉酸缺乏對PP2A甲基化的影響與機制，以正常葉酸(1 mg/L)、低葉酸(0.01 mg/L)和無葉酸(0 mg/L)條件分別干預不同遺傳修飾的鼠神經母瘤細胞24 h，發現無葉酸狀態下調

LCMT-1

轉錄、PP2A甲基化及其亞基Bα濃度，細胞凋亡壞死頻率增加；過表達

LCMT-1

或

B

α，均可以緩解無葉酸狀態誘發的PP2A去甲基化和tau磷酸化；該團隊對C57BL/6J小鼠飼以正常葉酸(6.7 mg/kg)、低葉酸(0.2 mg/kg)或無葉酸飲食2個月，發現小鼠前額葉皮質、中腦和小腦神經元PP2A甲基化水平降低、

LCMT-1

的下調。葉酸缺乏對于

LCMT-1

表達、Bα水平均具有負面影響。

Li等研究人員通過探討葉酸對tau磷酸化的影響，剖析可能存在的葉酸-PP2A-tau磷酸化-AD患病風險軸。研究以不同濃度葉酸(0～40 μmol/L)干預人SH-SY5Y神經細胞模型96 h，其間以10 nmol/L磷酸酯酶抑制劑(OA)暴露9 h。結果發現，OA處理細胞的tau-Ser396位點磷酸化程度隨葉酸濃度的增加而被抑制，在葉酸40 μmol/L時抑制效應最佳；研究還分析了葉酸干預后細胞的PP2A活性，發現隨著葉酸濃度增加，PP2A亞單位PP2Ac分子Leu309位點低甲基化被逆轉、tau磷酸化水平下降，研究提出了葉酸通過抑制PP2A去甲基化而下調tau磷酸化、降低AD風險的假說。

為揭示2型糖尿病患者中的AD發病率高于正常人群的機制，Zheng等以葉酸缺乏(0 mg/kg)、常規葉酸(15 mg/kg)、高葉酸膳食(15 mg/kg+120 μg/kg)，即在常規基礎上額外補充葉酸干預經鏈佐霉素建模的糖尿病小鼠8周，發現高濃度葉酸干預能顯著降低糖尿病小鼠腦內tau的Ser396位點過度磷酸化、PP2A甲基化、DNMT轉錄上調，葉酸通過調節糖尿病小鼠PP2A甲基化而降低tau磷酸化的結果支持葉酸可能作為改善糖尿病患者認知障礙的多靶點藥物。

4 結語與展望

國家統計局第七次全國人口普查數據顯示，我國60歲以上人口已達26 402萬人，占18.70%，其中，65歲及以上人口為19 064萬人，占13.50%，65歲及以上人口將成為增長最快的年齡組，人口老齡化程度進一步加深。AD作為一種高度異質性、病因復雜的進行性神經退行性疾病，嚴重影響人類生活質量、對公共健康和社會經濟提出了日益嚴峻的挑戰。65歲以后人群是AD發病高峰人群，對于快速增長的老齡人口和沉重的照護負擔，如何從眾多維度有效預防或延遲AD的發生發展，是當下社會面臨的緊迫問題！圍繞一碳代謝各類組分對腦細胞尤其是分化終端神經元基因組結構與表達的影響與機制，剖析一碳單位組分及遺傳變異對Aβ聚集和tau磷酸化、氧化脅迫與炎癥反應、離子通道與微環境穩態等生物學過程相關基因、酶功能的影響與機制，甄別目前該領域研究成果吻合度不盡人意的瓶頸所在，將是防范AD、推進公共健康發展的重要科學領域。