稻花香馫香型白酒酒曲酶活測定與高通量測序分析

崔雨欣，蔡開云，陳 萍，申登晉，曾宇倫，譚光迅，趙述淼

（1.華中農業大學生命科學技術學院，農業微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；2.湖北稻花香酒業股份有限公司，湖北宜昌 443100）

大曲是傳統固態白酒釀造的物質基礎。大曲是以大麥、小麥、豌豆等為原料，經粉碎、加水混捏、壓成曲醅并在人為控制的一定溫度和濕度條件下形成大小不一的塊狀物。作為糖化發酵劑，大曲含有豐富的微生物群落、功能酶系及在制曲過程中形成的風味前體物質，是白酒質量和產量的重要保障[1-2]。在大曲的制作過程中溫度是一項重要的指標，根據品溫的不同，大曲可分為低溫大曲、中溫大曲、中高溫大曲和高溫大曲。小曲是用米粉、米糠或麩皮，有的添加中草藥或觀音土，接入定量的母曲，在一定溫濕度條件下制成的[3]。小曲作為同樣重要的糖化發酵劑，是小曲白酒香氣的主要來源。根霉曲實質上是純種小曲[4]，將純種根霉菌和酵母菌分開培養并按一定比例混合制成釀酒所用根霉曲，從而使小曲的質量顯著提高[5]。在糖化階段根霉曲按一定比例與蒸泡攤晾后的原料混合并加入，促進糖化的順利進行，具有出酒率高，酒質穩定的優點。

馫香型白酒是湖北稻花香酒業股份有限公司開發一種創新型酒體。它的釀造工藝包括糖化培菌、高溫堆積、入窖發酵等過程，有效地結合了小曲清香型白酒的糖化培菌，醬香型白酒的高溫堆積以及濃香型白酒泥窖發酵的工藝特點，進而形成了獨特的馫香型白酒生產工藝，具體為：蒸煮后的高粱加小曲進行培菌糖化，隨后糖化好的酒醅配糟后加入高溫大曲進行高溫堆積，最后堆積好的酒醅加入中高溫大曲，進入泥窖開始發酵（圖1）。目前尚不清楚稻花香馫香型白酒釀造使用的3 種曲——根霉曲、中高溫大曲和高溫大曲的酶活力和微生物數量及組成，本研究測定了它們的酶活力和微生物數量，并進行了高通量測序，為馫香型白酒的生產及工藝改造提供指導。

圖1 新工藝白酒生產工藝流程圖

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：取自稻花香酒業生產的根霉曲（GM）、中高溫大曲（ZGW）和高溫大曲（GW），每種酒曲取3個批次。

培養基：孟加拉紅培養基和LB培養基。

1.2 理化性能的測定

酯化力、糖化力、液化力和酸性蛋白酶活力的測定均參照沈怡方《白酒生產技術全書》[6]所示的方法。

1.3 微生物數量的檢測

本實驗采用傳統的稀釋平板涂布法測定酒曲中的微生物數量。利用孟加拉紅培養基計數酵母菌和霉菌，利用LB 培養基計數細菌和芽孢桿菌。其中計數芽孢桿菌時先將稀釋好的樣品液置于80 ℃水浴15 min后再進行涂布[7]。

1.4 高通量測序

將3 種酒曲樣品提取DNA 并進行高通量測序（美吉測序公司，上海），OTU[8]（Operational Taxonomy Unit）分析、Alpha 多樣性分析[9]及物種注釋均通過美吉生物科技有限公司云平臺進行（https://cloud.majorbio.com/），試驗數據利用SPSS21.0 統計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性檢驗，以P＜0.05為差異顯著水平，標注各組差異性。

2 結果與分析

2.1 理化性質

根霉曲、中高溫大曲和高溫大曲的各項理化性質見表1。

表1 不同工藝曲理化指標

由表1 可知，3 種曲的糖化力具有明顯差異，中高溫大曲糖化力最高；根霉曲的液化力、酸性蛋白酶活力和酯化力最高，與其他兩種曲差異性顯著，分別達16.36 U/g、189.32 U/g和164.69 mg/g。

2.2 微生物計數

采用傳統的稀釋平板涂布法對酒曲中的霉菌、酵母菌、細菌和芽孢桿菌進行計數，結果見表2。

表2 3種曲中不同種類微生物數量

計數結果表明，高溫大曲和中高溫大曲的酵母菌數量差異不顯著，而根霉曲中沒有檢測到酵母；中高溫大曲和根霉曲的霉菌數量顯著高于高溫大曲，超出一個數量級；中高溫大曲芽孢桿菌顯著高于高溫大曲，總細菌無顯著差異，而根霉曲中未檢測到細菌和芽孢桿菌。

2.3 高通量測序結果

2.3.1 樣品多樣性

對稻花香馫香型白酒酒曲樣品的細菌和真菌群落進行高通量測序分析，結果見表3。由表3 可知，中高溫大曲和高溫大曲細菌的Shannon 指數都大于1，與根霉曲有顯著差異。而3 種曲真菌群落的Shannon 指數都具有明顯差異性，其中中高溫大曲的Shannon指數最高。

表3 細菌和真菌群落的Shannon指數表

2.3.2 高通量測序分析微生物群落組成

在門水平和屬水平上分別計算了各樣本的細菌群落的物種平均相對豐度（n=3），如圖2 所示。（1）高溫大曲（GW）在門水平上的優勢菌群（平均相對豐度＞1%）包括Firmicutes（厚壁菌門，50.13%），Proreobacteria（變形菌門，33.13%）和Actinobacteria（放線菌門，15.84%）；在屬水平上有Bacillus（芽孢桿菌屬，32 %），Kroppenstedtia（21.6 %），Saccharopolyspora（糖多孢菌屬，18.06 %），Thermoactinomyces（高溫放線菌屬，9.01 % ），Norank_f_Pseudonocardiaceae（4.93 %），Planifilum（3.4 %），Staphylococcus（葡萄球菌屬，3.13 %）和Pediococcus（片球菌屬，1.75 %）。（2）中高溫大曲（ZGW）在門水平上的優勢菌群有Firmicutes（厚壁菌門，50.76%），Proteobacteria（變形菌門，21.21%）和Actinobacteria（放線菌門，14.81%）；在屬水平上有Bacillus（芽孢桿菌屬，17.96 %），Kroppenstedtia（16.23 %），Thermoactinomyces（高溫放線菌屬，8.73%），Weissella（魏斯氏菌屬，5.48%），Lactobacillus（乳桿菌屬，3.8 %），Pediococcus（片球菌屬，2.46 %），Planifilum（1.96 %）和Staphylococcus（葡萄球菌屬，1.69%）。（3）根霉曲在目水平未分類。

圖2 樣品門水平（A）和屬水平（B）的細菌豐度比例圖

在門水平和屬水平上分別計算了各樣本的真菌群落的物種平均相對豐度（n=3），如圖3 所示。（1）高溫曲（GW）在門水平上的優勢菌群（平均相對豐度>1 %）為Ascomycota（子囊菌門，99.86 %），在屬水平上有Thermomyces（嗜熱真菌屬，79.49 %），Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，13.98 %），Aspergillus（曲霉菌屬，1.91 %）。（2）中高溫大曲（ZGW）在門水平上的優勢菌群有Ascomycota（子囊門，86.27%），Mucoromycota（毛霉門，5.46%）和Basidiomycota（擔子菌門，8.19 %）；在屬水平上有Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，62.72 %），Thermomy-ces（嗜熱真菌屬，4.53 %），Cutaneotrichosporon（5.56%），Candida（假絲酵母屬，3.53%），Rhizopus（根霉菌屬，5.36 %），Aspergillus（曲霉菌屬，3.04 %），Hyphopichia（2.29 %），Trichomonascus（2.29 %）和Xeromyces（耐干霉菌屬，1.89 %）。（3）Rhizopus（根霉菌）作為根霉曲中的優勢菌種，豐度達99.99%。

圖3 樣品門水平（A）和屬水平（B）真菌豐度比例圖

2.4 物種Venn圖

Venn 圖能夠得到不同樣品之間相同的物種組成，3 種曲的Venn 圖分析如圖4 所示。3 種曲共有的細菌屬有25 種，中高溫大曲和高溫大曲共有的細菌屬有185 種，中高溫大曲和高溫大曲分別與根霉曲的物種重合有37 和26 種。其中，中高溫大曲物種最為豐富，達591 種，高溫大曲210 種，而根霉曲只有41 種。3 種曲共有的真菌屬有4 種，中高溫大曲和高溫大曲共有39 種。其中物種最多的是中高溫大曲96 種，而高溫大曲和根霉曲分別只有49種和5種。

圖4 樣品屬水平細菌（A）和真菌（B）venn圖

3 討論

作為白酒釀造過程中起重要作用的液化酶和糖化酶，直接影響著原料中淀粉的轉化效率及出酒率。酸性蛋白酶可以分解原料中的大分子蛋白，為微生物生長提供氮源，促進發酵[10-12]。酯化力是大曲自身經發酵成熟后固有的催化醇和羧酸生成酯的能力，而生成的酯是濃（醬）香型白酒重要的主體香味物質[13]。本研究發現，中高溫大曲的糖化力更高；根霉曲的酸性蛋白酶活和酯化力大于高溫大曲和中高溫大曲。因此3 種曲在稻花香馫香型白酒釀造的不同階段加入，不僅有利于提高出酒率，還有利于馫香型香氣的形成。

大曲微生物代謝產生的乙醇和各種風味物質，是白酒的關鍵組分。本研究首先使用平板計數測定微生物數量，結果表明，中高溫大曲的霉菌、酵母菌、芽孢桿菌以及總細菌數量高于高溫大曲。微生物計數雖然對微生物進行了絕對定量，并側面反映了大曲中微生物的生長趨勢，但由于僅僅反映的是可培養微生物，且受環境中的溫度、濕度和氣候等因素影響很大,因此，對大曲微生物的認識存在很大的局限性。本研究針對上述問題，通過高通量測序技術分析了稻花香馫香白酒3 種酒曲微生物群落多樣性及組成。在測定的3 種酒曲中，根霉曲的Shannon 指數最小，其中根霉菌的相對豐度達99.99 %，而中高溫大曲相比高溫大曲和根霉曲而言，其細菌和真菌群落的Shannon 指數更高，具有更高的物種豐富度和均勻度，并且在屬水平上擁有近600 種細菌，真菌也有將近100 種。這可能是由于高溫大曲的品溫過高，引起不耐高溫微生物在制曲過程中死亡；而根霉曲采用的是純種制曲，基本以根霉菌為主，也包括極少量來自環境及工具的細菌。

制曲溫度影響著大曲微生物群落結構的組成。本研究發現，中高溫大曲和高溫大曲細菌群落都由Bacillus（芽孢桿菌屬）占主導地位，豐度分別為17.96%和32%，側面印證了傳統稀釋涂平板法中芽孢桿菌占總細菌的絕大多數的結果。同時還發現中高溫大曲的細菌相較于高溫大曲而言，Thermoactinomyces（高溫放線菌屬）和Bacillus（芽孢桿菌屬）明顯下降。芽孢桿菌產多種蛋白酶，是大曲中風味物質的主要來源。高溫放線菌屬常見于自然界高溫場所，具備耐高溫特性，適應大曲發酵中的高溫環境，具備開發高溫淀粉酶、蛋白酶、酯酶、脫氫酶和多酚氧化酶等潛力[14]。在真菌群落組成中，Thermomyces（嗜熱真菌屬）在高溫大曲的相對豐度遠高于中高溫大曲（4.53 %），達79.49 %。而Thermoascus（嗜熱子囊菌屬）作為中高溫大曲中占主導地位的真菌屬，相對豐度達62.72%，遠高于高溫大曲中的豐度（13.98%）。嗜熱真菌屬產木聚糖酶和蛋白酶等酶類，李欣等[15]發現嗜熱真菌屬是酒醅發酵過程中產酶的主要功能菌。嗜熱子囊菌產纖維素酶和蛋白酶，可降解糖類和蛋白質等并具有良好的熱穩定性,有利于大曲產酒生香作用[16]。兩種大曲擁有不同的微生物群落組成，可能是由于不同的制曲溫度引起的：高溫大曲培菌溫度在63～68 ℃之間，中高溫大曲培菌溫度在55～60 ℃之間。根霉曲中，根霉菌產糖化酶、液化酶、蛋白酶和脂肪酶，還能產生各種有機酸，可為其他微生物的代謝提供基礎物質，對整個糖化發酵過程以及白酒的風味都具有一定影響。

本研究系統性地檢測分析了稻花香酒廠用于馫香型白酒釀造的3 種曲（中高溫大曲、高溫大曲和根霉曲）中微生物的群落結構，同時對曲樣的酶學指標進行測定，簡單分析了酒曲中細菌真菌數量及群落結構的差異和酶活力之間的關系，為優化稻花香酒曲工藝、提高酒曲質量提供了參考依據，具有理論和實踐意義。