miR-322-5p通過NOX4調控細胞凋亡抑制大鼠神經管畸形發生

黃琬淇，劉玉思，顧卉，袁正偉

（中國醫科大學附屬盛京醫院，國家衛生健康委員會小兒先天畸形重點實驗室，沈陽 110004）

神經管畸形（neural tube defects，NTDs）作為最嚴重的出生缺陷之一，全球發病率約為1‰～10‰［1］。由于神經管的閉合失敗，可出現如無腦兒、脊柱裂、腦脊髓膜膨出等一系列表型［2］。神經上皮細胞的過度凋亡導致神經管閉合異常，產生NTDs［3］。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可通過誘導細胞凋亡活動影響神經管閉合，引起NTDs的發生［4-5］，本研究組前期利用ATRA成功制作了NTDs胎鼠模型。

微RNA（microRNAs，miRNA）是一種長度為22～24 nt的內源性小型非編碼 RNA 分子，通過與靶基因的3’端非翻譯區（3’untranslated regions，3’-UTR）結合，誘導mRNA降解或抑制翻譯，從而調控靶基因的轉錄和表達［6］。miR-322是細胞增殖、分化、凋亡等生物學活動的重要調控因子，對于心血管系統、神經系統及其他器官均有一定的保護作用［7-8］。研究發現，miR-322-5p可抑制高糖誘導的小鼠神經干細胞凋亡和NTDs的發生。本課題組前期研究［9-10］發現，胚胎體外注射miR-322-5p-mimic，對NTDs有治療作用。但它與ATRA誘導的大鼠NTDs的關系仍有待研究。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）是NADPH氧化酶家族的一個亞型成員，它的過表達可導致神經元的自身毒性以及大腦的局部缺血［11］。在高糖誘導的神經病變動物模型中，周圍神經系統施旺細胞NOX4表達上調，促進細胞氧化應激參與周圍神經損傷［12］。但NOX4在ATRA誘導的大鼠NTDs中的表達及作用尚未見報道。通過TargetScan及starBase生物信息學分析發現，NOX4是miR-322-5p的靶點，在NOX4mRNA的非翻譯區存在miR-32-5p的潛在結合位點。本研究擬觀察miR-322-5p與NOX4在ATRA誘導的大鼠NTDs模型中的表達及其對凋亡活動的影響，探討NTDs的發生機制，以為其診療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠神經干細胞（C17.2，貝納創聯生物研究所），ATRA（美國Sigma公司），MEM培養基（美國Gibco公司），MEM NEAA（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素鏈霉素溶液/雙抗（美國Hyclone公 司），miR-322-5p mimics/inhibitor、mimics/inhibitor-NC（上海吉瑪制藥技術有限公司），NOX4 plasmid（上海吉凱基因化學技術有限公司）。JetPRIME（法國PolyPlus-transfection公司），miRNeasy Mini Kit（美國Qiagen公司），miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司），SYBR Premix Ex Taq Kit（大連寶生物工程有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），NOX4兔多克隆抗體（美國Rocklamd公司），Bcl-2鼠多克隆抗體（美國Sigma公司），Bax兔多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/抗小鼠IgG（美國Proteintech公司），UltraSensitive SP IHC kit、辣根過氧化氫DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠NTDs模型制備及組織樣本收集：Wistar大鼠（北京華阜康生物技術有限公司）飼養于中國醫科大學附屬盛京醫院SPF級實驗動物房，按雌∶雄為2 ∶1于前一晚合籠，第二日早將大鼠分籠，陰道涂片見精子的雌鼠單獨放于一籠，記為孕0 d（E0）。于E10將已孕雌性大鼠隨機分為2組，NTDs組灌胃140 mg/kg橄欖油溶解的ATRA，對照組給予同體積的橄欖油灌胃。于E11剖宮取出胎鼠，獲取脊髓組織。

1.2.2 免疫組織化學染色：將胚鼠脊髓固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，于去離子水中水化。抗原修復后，使用UltraSensitive SP IHC試劑盒處理切片，滴加一抗anti-NOX4（1 ∶800），4 ℃孵育過夜，第二日DAB顯色，蘇木素復染，流水返藍1 h除去余色，封片拍照。

1.2.3 免疫熒光染色：切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫水，去離子水水化，0.1% Triton X-100處理。動物血清封閉后，加入anti-NOX4抗體（1 ∶1 000），4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，室溫熒光標記的二抗孵育（1 ∶200）2 h。DAPI染色，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 細胞的培養和轉染：用含10%胎牛血清、1%MEM NEAA、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養液在37 ℃、5%CO2培養箱中培養小鼠神經干細胞C17.2。接種細胞至6孔板，轉染前培養24 h。以JetPRIME為轉染試劑，轉染miRNA-空白對照（miRNC）、miR-322-5p mimic、miR-322-5p inhibitor以 及NOX4高表達質粒至C17.2細胞。

1.2.5 實時定量PCR：用miRNeasy Mini試劑盒從胚胎脊髓組織和C17.2中提取總RNA，用miRNA First Strand cDNA Synthesis反轉錄RNA。以U6為內參，用SYBR Premix Ex Taq試劑盒行實時定量PCR。引物序列如下：miR-322-5p F鏈為AGCAGCAATTCATGTTT TGGAA，R鏈為GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC；U6F鏈為CTCGCTTCGGCAGCACA，R鏈為AACGCT TCACGAATTTGCGT；β-actinF鏈為GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA，R鏈為GACTCATCGTACTCCTGCTT GCTG。

1.2.6 Western blotting：自胚胎脊髓和C17.2細胞中提取蛋白質。SDS-PAGE電泳分離，電轉印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗 NOX4（1 ∶1 000），Bax（1 ∶1 000），Bcl-2（1 ∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次（10 min/次），室溫下與HRP兔和鼠二抗（1 ∶5 000）孵育2 h，ECL發光。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，并用 GraphPad 8.0統計軟件作圖。計量資料以表示，采用獨立樣本t檢驗進行比較。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-322-5p和NOX4在大鼠NTDs形成中的表達

2.1.1 ATRA誘導的NTDs胎鼠脊髓組織神經管形態及NOX4定位表達情況：免疫組織化學染色和組織免疫熒光結果顯示，NTDs組神經管形態明顯異常，且胚胎脊髓中NOX4表達顯著高于對照組，見圖1。

圖1 E11對照組和NTDs組大鼠胚胎脊髓組織神經管的形態和NOX4表達情況 ×200Fig.1 Morphology and NOX4 expression of spinal cord neural tube between E11 control and NTDs rats ×200

2.1.2 miR-322-5p和NOX4在NTDs胎鼠脊髓組織中的表達情況：實時定量PCR和Western blotting結果顯示，與對照組相比，NTDs組脊髓組織中miR-322-5p mRNA和蛋白表達水平明顯下調（均P＜ 0.05），見圖2。提示miR-322-5p的表達對NTDs可能有抑制作用，而NOX4可能促進NTDs的形成。

圖2 E11對照組和NTDs組大鼠胚胎脊髓組織miR-322-5p和NOX4表達情況Fig.2 Comprison of miR-322-5p mRNA and NOX4 protein expression in the embryonic rat spinal cord tissues between control and NTDs groups

2.2 ATRA致畸胎鼠脊髓中凋亡蛋白的表達情況

Western blotting結果顯示，ATRA誘導的NTDs組中，NOX4蛋白表達顯著上調，促凋亡蛋白Bax表達增強，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減弱（P＜ 0.05），見圖3。表明NTDs胎鼠脊髓中細胞凋亡增加，提示NOX4可能促進凋亡的發生。

圖3 凋亡相關蛋白在對照組和NTDs組胎鼠脊髓組織中的表達情況Fig.3 The expression of apoptosis-related proteins in the embryonic rat spinal cord of control and NTDs groups

2.3 miR-322-5p負調控NOX4的表達并減少細胞凋亡

2.3.1 轉 染miR-322-5p mimics和inhibitor后C17.2神經干細胞中NOX4的表達：Western blotting結果顯示，C17.2細胞中轉染miR-322-5p mimic 48 h后，miR-322-5p表達水平顯著上調（圖4 A，P＜ 0.05），NOX4蛋白表達下調（圖4B、4C，P＜ 0.05）；轉染miR-322-5p inhibitor后，miR-322-5p表達水平下調（圖4D，P＜0.05），NOX4表達下調（圖4E、4F，P＜ 0.05）

圖4 轉染miR-322 mimic/inhibitor對C17.2細胞中NOX4表達的影響Fig.4 Regulation of NOX4 after transfection of miR-322 mimic/inhibitor

2.3.2 miR-322/NOX4對神經干細胞的凋亡的影響：Western blotting結果顯示，轉染NOX4高表達質粒的神經干細胞中，NOX4過表達，促凋亡基因Bax蛋白表達上調，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達下調。miR-322-5p mimic與NOX4過表達載體共轉染細胞后，miR-322-5p mimic抑制NOX4表達的同時，也抑制了Bax表達，促進了Bcl-2表達（P＜ 0.05），見圖5。提示miR-322-5p能夠通過抑制NOX4表達抑制神經干細胞的凋亡。

圖5 C17.2細胞轉染miR-322-5p mimic和NOX4后NOX4和凋亡蛋白的表達水平Fig.5 Expression of NOX4 and apoptotic proteins after transfection miR-322-5p mimic and NOX4 of C17.2

3 討論

NTDs作為一種多因素疾病，對于其發病機制的了解仍較局限。本研究利用ATRA誘導大鼠NTDs模型，發現NOX4作為miR-322-5p的靶標，可以通過參與細胞凋亡調控大鼠神經管閉合的過程，在大鼠NTDs發生中扮演重要角色。

細胞凋亡對于維持胚胎的正常發育具有重要作用，在神經管閉合進程中，中線細胞的過度凋亡導致神經管的閉合失敗以及一系列NTDs表型的形成［13］。研究［14］發現，miRNA對NTDs具有調控作用。在高糖環境下，miR-129-2通過抑制細胞自噬可誘導NTDs發生［15］。本課題組前期研究［16］發現，孕產婦糖尿病或體外高血糖會增加miR-200b的水平，CITED2是miR-200b的靶標，被高糖下調。由此可見，miR-200b抑制劑可逆轉培養的胚胎中高葡萄糖誘導的CITED2下調，內質網應激，進而改善胚胎發育中的NTDs。miR-322也參與了細胞凋亡活動的調控［17］。缺氧條件可引起心肌細胞出現凋亡，并伴隨miR-322明顯上調［18］。本研究組前期還發現miR-322-5p可以通過抑制TRAF3減少高糖誘導的神經干細胞凋亡［9］。但miR-322-5p是否參與ATRA誘導的大鼠NTDs尚無報道。

NOX4作為NOX酶家族成員是細胞超氧陰離子的來源，參與中樞神經系統的發育、神經干細胞生物學以及成熟神經元的功能［19］，并可通過產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）來誘導細胞發生氧化應激，進而導致細胞凋亡。研究［20-21］顯示，糖皮質激素可通過NOX4/ROS/p38 MAPK途徑誘導軟骨細胞凋亡，心肌細胞NOX4高表達，凋亡也隨之增加。由于神經元的抗氧化性較弱，ROS的產生是神經系統疾病和細胞凋亡的主要因素。NOX4對神經元的凋亡也具有相似作用，它參與大鼠缺血再灌注過程中ROS誘導的神經元凋亡和腦損傷［22］。此外，慢性氟暴露會誘導中樞神經系統發生氧化應激，誘導NOX4的表達，而NOX4高表達會導致血腦屏障損害，小膠質細胞活化和神經元喪失，從而導致腦功能受損［23］。但關于大鼠NTDs胚胎中脊髓NOX4的表達尚無研究。本研究結果顯示，在NTDs胎鼠模型脊髓中，NOX4表達水平上調，且伴隨促凋亡相關蛋白表達增加，抗凋亡相關蛋白減少。結合生物信息學分析的結果，NOX4是miR-322-5p的靶基因，當神經干細胞C17.2在轉染NOX4高表達質粒的同時轉染miR-322模擬物，可降低NOX4的表達水平，且伴隨抗凋亡相關蛋白增加，促凋亡蛋白減少。由此可見，miR-322-5p能夠抑制NOX4的表達，抑制神經管發育過程神經細胞的過度凋亡。

綜上所述，miR-322-5p能夠下調NOX4的表達，減少大鼠胚胎神經管閉合過程中細胞凋亡，減少NTDs的發生，因此，miR-322-5p可能成為NTDs治療的新靶點。