CDK4-pRB-E2F1通路在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用

叢明，單偉，石玉秀

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指人遭受突發(fā)的巨大災(zāi)難或嚴(yán)重威脅而出現(xiàn)并長(zhǎng)期存在的精神障礙［1］。研究［2］顯示，PTSD患者大腦杏仁核組織出現(xiàn)體積縮小、細(xì)胞死亡等病理改變。本課題組前期研究［3-4］證實(shí)了PTSD造模大鼠杏仁核及海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞均發(fā)生了凋亡；結(jié)果顯示，PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞周期因子CDK4和 CyclinD1表達(dá)增高，而且這種表達(dá)增高時(shí)間與細(xì)胞凋亡時(shí)間接近，說(shuō)明PTSD可能引起細(xì)胞周期的異常重啟，從而造成了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。WANG等［5］在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期因子pRB和E2F1存在異常高表達(dá)，這種高表達(dá)是損傷刺激激活了CDK4/Cyclin D1-pRB-E2F信號(hào)通路引起的；而pRB［6-7］和E2F1［8-9］高表達(dá)誘導(dǎo)受損的成熟神經(jīng)細(xì)胞最終走向凋亡。

本研究采用Wistar大鼠建立了單一連續(xù)應(yīng)激（single-prolonged stress，SPS）經(jīng)典PTSD動(dòng)物模型，探討了CDK4-pRB-E2F1通路在 PTSD引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取健康雄性8～10周齡Wistar大鼠50只（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（150±20）g。大鼠分隔飼養(yǎng)，每12 h光照與黑暗交替，溫度22～25℃，大鼠可自由攝取食物和水。SPS處理后1 d、4 d、7 d、14 d將大鼠隨機(jī)分為4組，將未做任何處理大鼠作為對(duì)照組，每組10只。

1.2 PTSD大鼠模型建立

采用SPS刺激方法建立PTSD大鼠模型，具體步驟：（1）用剪開(kāi)的塑料礦泉水瓶（500 mL）將大鼠固定、禁錮2 h；（2）將大鼠放入水深40 cm、水溫25 ℃左右的水池中游泳20 min；（3）將大鼠從水池中夾出，放置恢復(fù)15 min，然后乙醚麻醉大鼠；（4）大鼠放回籠子中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將對(duì)照組和SPS 7 d組大鼠分別放入同樣條件下的四方形曠場(chǎng)箱中，安靜觀察并記錄大鼠在5 min內(nèi)進(jìn)入曠場(chǎng)箱中央位置區(qū)域范圍的次數(shù)，穿越中心區(qū)域次數(shù)越少代表焦慮狀態(tài)越嚴(yán)重。

1.3.2 僵立行為測(cè)定：僵立行為是嚙齒類動(dòng)物在受到驚嚇后，保持一種僵硬蹲伏狀態(tài)的行為，提示動(dòng)物存在恐懼記憶。將對(duì)照組和SPS 7 d組大鼠先后放入前期大鼠游泳使用的水池內(nèi)，安靜觀察大鼠5 min，每隔10 s檢測(cè)1次，記錄大鼠表現(xiàn)出僵立行為的次數(shù)。僵立行為=僵立行為次數(shù)/觀察總次數(shù)×100%。

1.3.3 Western blotting檢測(cè)pRB、E2F1表達(dá)：各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉注射液麻醉，麻醉成功后將大鼠放于冰面上，迅速取出杏仁核腦組織。將取出腦組織勻漿和超聲粉碎處理后，4 ℃，12 000 r/min離心20～30 min，離心后提取上清液；采取考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定標(biāo)本蛋白濃度，按照每份標(biāo)本蛋白含量50 μg標(biāo)準(zhǔn)提取樣本；采用10%SDS-PAGE 凝膠電泳后，采用恒壓下轉(zhuǎn)PVDF膜處理，將PVDF膜裁剪、封閉和漂洗后，分別滴加兔來(lái)源pRB抗體（1∶600）和兔來(lái)源E2F1抗體（1∶500），4 ℃封閉條件下過(guò)夜；應(yīng)用TBST液清洗膜3次，每次15 min；分別加入羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG抗體（1：1 000），室溫條件下孵育2 h，經(jīng)TBST液清洗膜3次后ECL發(fā)光液顯色。使用 Fluorchem V2.0 系統(tǒng)測(cè)定目標(biāo)條帶吸光度，然后分別計(jì)算目標(biāo)條帶的平均吸光度值和作為參照的GAPDH條帶的平均吸光度值，兩者比值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)RBmRNA、E2F1mRNA表達(dá)：按照1.3.3方法麻醉大鼠后獲取杏仁核腦組織，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 。擴(kuò)增反應(yīng)體系，SYBR 10 μL，PCR上段引物0.4 μL，PCR下段引物0.4 μL，模板cDNA 2 μL，DEPC水7.2 μL；PCR引物序列見(jiàn)表1。采用LightCycler 480型PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)和結(jié)果測(cè)試。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用表示。組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和SPS 7d組多數(shù)時(shí)間在箱壁周圍范圍內(nèi)活動(dòng)，其活動(dòng)軌跡呈現(xiàn)沿壁活動(dòng)的特性。對(duì)照組和SPS 7 d組大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)箱中央位置區(qū)域次數(shù)分別為8.20±1.87、1.50±0.85，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。僵立行為測(cè)試結(jié)果顯示，對(duì)照組和SPS 7 d組表現(xiàn)截然不同。SPS 7 d組大鼠典型僵立蹲伏動(dòng)作增多，其他活動(dòng)行為頻率降低，時(shí)常出現(xiàn)頭、背毛發(fā)豎起等警覺(jué)動(dòng)作；而對(duì)照組大鼠活動(dòng)自如，僵立蹲伏動(dòng)作較少。對(duì)照組和SPS 7d組大鼠僵立行為分別為（11.00±5.24）%、（56.67±8.61）%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組pRB和E2F1蛋白表達(dá)結(jié)果

結(jié)果顯示，SPS各組大鼠pRB和E2F1蛋白表達(dá)均較對(duì)照組增高。與對(duì)照組比較，SPS 7 d組和SPS 14 d組pRB和E2F1蛋白表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組pRB、E2F1蛋白表達(dá)Fig.1 Protein Expression of pRB and E2F1 in each group

2.3 各組RB mRNA、E2F1 mRNA表達(dá)結(jié)果

結(jié)果顯示，SPS各組大鼠RB、E2F1mRNA表達(dá)均較對(duì)照組增高。與對(duì)照組比較，SPS 4 d組、SPS 7 d組、SPS 14 d組RBmRNA表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05）；SPS 7 d組、SPS 14 d組E2F1mRNA表達(dá)顯著增高（P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組RB mRNA、E2F1 mRNA表達(dá)結(jié)果比較Tab.2 Expression of Rb mRNA and E2F1 mRNA in each group

3 討論

已有研究［10］表明PTSD杏仁核組織發(fā)生病理變化，從而證實(shí)了PTSD產(chǎn)生的異常增強(qiáng)的恐懼記憶、焦慮等癥狀的根源很可能在杏仁核等邊緣系統(tǒng)。本研究中曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和僵立行為測(cè)試顯示，SPS刺激后大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)箱中央位置區(qū)域范圍的次數(shù)顯著減少，典型僵立蹲伏動(dòng)作增多，時(shí)常出現(xiàn)頭、背毛發(fā)豎起等警覺(jué)動(dòng)作，說(shuō)明SPS刺激引起大鼠產(chǎn)生恐懼、焦慮的癥狀，證實(shí)PTSD模型建模成功。

在RB蛋白與E2F1轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，RB蛋白被CDK4/CDK6-CyclinD復(fù)合物磷酸化，進(jìn)而將E2F1從RB-E2F1復(fù)合物中游離出來(lái)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期［11］。因此，CDK4、CDK6、Cyclin D蛋白、RB蛋白和E2F1轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成了一條完整的調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的鏈條，形成了CDK/Cyclin D-pRB-E2F 信號(hào)傳導(dǎo)通路。已有研究［5，12-13］證實(shí)中樞神經(jīng)損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CDK4、Cyclin D1、pRB和E2F1等細(xì)胞周期相關(guān)因子異常高表達(dá)，說(shuō)明可能激活了CDK4/Cyclin D1-pRB-E2F 信號(hào)通路，重啟細(xì)胞周期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示SPS 刺激后pRB和E2F1表達(dá)增加，其表達(dá)升高趨勢(shì)與前期研究［4］CyclinD1、CDK4表達(dá)升高趨勢(shì)基本相同。因此推測(cè)PTSD中CDK4-pRB-E2F1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，細(xì)胞周期重啟，進(jìn)而誘導(dǎo)了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。目前，關(guān)于CDK4-pRB-E2F1通路引起細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，游離的E2F1可能通過(guò)阻斷抗凋亡信號(hào)、依賴p53凋亡基因和非依賴p53凋亡基因等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PTSD大鼠杏仁核神經(jīng)細(xì)胞中pRB及E2F1高表達(dá)，CDK4-pRB-E2F1通路可能參與了PTSD杏仁核神經(jīng)細(xì)胞的調(diào)亡。但PTSD中E2F1轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)何種具體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡，以及如何對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)因子進(jìn)行干預(yù)的尚不清楚，今后將進(jìn)一步研究、論證。