槐耳對急性腎損傷后腎纖維化小鼠內質網應激和凋亡的影響

趙晶瑩，吳玉斌

（中國醫科大學附屬盛京醫院小兒腎臟風濕免疫科，沈陽 110004）

近年來，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）和慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的發病率呈上升趨勢。研究［1］表明AKI是CKD的獨立危險因素。AKI后腎臟不良修復會導致進行性腎纖維化和CKD。由AKI發展而來的CKD稱為AKI-CKD轉變［1-2］。研究［3-5］表明，AKI后隨著時間延長，血清肌酐可以回歸到基線水平，但腎內細胞炎癥反應仍持續存在，導致腎纖維化和長期腎功能不全。在這過程中，缺氧、營養物質不足、ATP消耗、活性氧產生和Ca2+穩態破壞可引起內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。

槐耳是一種生長在槐樹樹干上的淺褐色傘菌類真菌，作為中藥已有1 500余年歷史。研究［6］顯示槐耳提取物治療的不良反應很少。已有研究［7-8］表明槐耳對腎臟損傷有保護作用。然而槐耳在AKI-CKD轉變中的作用及其與ERS的關系研究鮮有報道。本研究采用缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）建造AKI-CKD小鼠模型，探討槐耳對AKI-CKD轉變的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品及分組

72只雄性6～8周齡C57BL/6小鼠購自遼寧長生生物有限公司，動物飼養于SPF級實驗室，溫度為（25±2）℃，濕度50%～70%，晝夜節律12 h光照/12 h黑暗，正常飲食。槐耳浸膏由啟東蓋天力藥業有限公司提供。將小鼠隨機分為3組：假手術（Sham）組、IRI組和槐耳治療（IRI+Huaier）組，每組24只。

1.2 模型制備與給藥

IRI組進行缺血再灌注手術，小鼠戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定在手術臺上，局部皮膚脫毛，無菌下行腹部正中切口，找到腎動脈，利用非創傷性微血管夾，夾閉雙側腎蒂30 min；Sham組只開腹；在腎缺血期間暫時關腹，去除微血管夾后確定腎動脈再灌注成功后分層縫合關閉腹腔。IRI+Huaier組操作同IRI組，手術后3 d開始槐耳浸膏［6 g/（kg·d）］灌胃，持續至術后28 d。

1.3 方法

1.3.1 腎功能檢測：各組小鼠分別于造模后24 h、3 d、7 d、14 d、28 d尾靜脈采血，常溫靜置2 h，4 ℃離心10 min，分離血清，留取標本后-20 ℃保存。采用脲酶UV法檢測血肌酐水平。

1.3.2 ELISA檢測：血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）水平測定按照ELISA試劑盒（SEB388Mu，武漢Uscnk公司）說明書操作進行。

1.3.3 腎組織形態學觀察：于造模后28 d處死各組小鼠，剖腹取腎，用10%多聚甲醛固定，制作石蠟切片（片厚3 μm），HE染色，復染，脫水、透明后用中性樹膠封片，光鏡下觀察腎組織形態學改變。腎組織中膠原形成情況檢測：各組小鼠于造模后28 d處死，剖腹取腎，10%多聚甲醛固定，制作石蠟切片（片厚3 μm），Masson染色觀察腎臟膠原形成、腎臟纖維化程度，計算各組腎小管損傷評分和間質纖維化百分比［9］。

1.3.4 Western blotting檢測ERS相關分子GRP78、CHOP表達：提取造模后28 d腎組織蛋白，加入上樣緩沖液后依次上樣，并加入Marker蛋白，電泳起始電壓為80 V，當溴酚蘭移動到分離膠時改為120 V電壓，當溴酚蘭跑出膠面時關閉電源終止電泳。電泳結束后，將分離的蛋白條帶轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，進行一抗（GRP78、CHOP 抗體）孵育，隨后進行二抗孵育，洗膜，配制ECL底物發光液，化學發光成像系統C300進行顯色發光，采用Image J軟件分析蛋白質條帶的光密度值。

1.3.5 TUNEL實驗：組織切片脫蠟至水后滴加0.1%Triton X-100（0.1%檸檬酸鈉鹽配置）50 μL，室溫放置8 min。PBS漂洗3次，5 min/次。配制TUNEL反應液：Enzyme solution及Label Solution按1 ∶9配 制，滴 加TUNEL反應液（50 μL）。保濕、避光、37 ℃孵育60 min。PBS漂洗，滴加DAPI至完全覆蓋組織，避光復染5 min。PBS漂洗，滴加熒光淬滅劑封片。顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.4 統計學分析

數據處理采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠AKI后腎纖維化模型構建

結果顯示，術后IRI組各時間點肌酐水平均較Sham組升高（P＜ 0.05）。小鼠在IRI術后24 h血肌酐明顯升高，達到最高峰，術后第3天肌酐水平下降，第7天肌酐迅速下降，第28天肌酐顯著下降，腎功能明顯恢復。說明小鼠AKI后腎纖維化模型成功構建。IRI+Huaier組術后7 d和28 d肌酐水平均較IRI組下降，腎功能較IRI組恢復明顯（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠術后各時間血清肌酐水平比較Fig.1 Comparison of serum creatinine levels after surgery among the three groups

2.2 各組腎組織形態學觀察結果

HE染色結果：光鏡下可見Sham組小鼠腎小管基底膜完整，小管上皮細胞結構清晰，無炎癥細胞浸潤；IRI組腎小管彌漫性擴張，腎小管上皮細胞腫脹變性、壞死，部分萎縮、刷狀緣消失，間質可見彌漫單核細胞浸潤，間質纖維化；IRI+Huaier組小鼠腎間質纖維化程度明顯減輕，腎小管上皮細胞無萎縮和代償性肥大，未見間質水腫。Masson染色結果：與Sham組比較，IRI組膠原纖維增多，腎間質增寬，間質細胞及細胞外基質成分增多，表現為多灶狀纖維化；IRI+Huaier組腎臟纖維化程度低于IRI組，但仍高于Sham組。術后28 d IRI組腎臟損傷及纖維化程度較Sham組升高（P＜ 0.01），而IRI+Huaier組較IRI組腎臟損傷及纖維化程度減輕（P＜ 0.01）。IRI組術后28 d NGAL水平較Sham組明顯上調（P＜ 0.001）；而IRI+Huaier組NGAL水平較IRI組明顯降低（P＜ 0.001），見圖2。

圖2 3組腎損傷和纖維化程度比較Fig.2 Degree of renal injury and fibrosis in each group

2.3 Western blotting檢測各組小鼠腎組織GRP78、CHOP 蛋白的表達

結果顯示，IRI組GRP78、CHOP表達與Sham組比較明顯增加（P＜ 0.01），IRI+Huaier組GRP78表達與IRI組比較顯著下降（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 Western blotting檢測各組GRP78、CHOP蛋白的表達Fig.3 GRP78 and CHOP protein expression in the kidneys by Western blotting

2.4 TUNEL法檢測各組細胞凋亡結果

Annexin V/PI雙染色顯示，Sham組、IRI組、IRI+Huaier組凋亡細胞百分比分別為（1.32±0.36）%、（12.34±1.99）%、（8.16±1.60）%，與Sham組比較，IRI組凋亡細胞明顯增加（P＜ 0.001）；與IRI組比較，IRI+Huaier組凋亡細胞明顯減少（P＜ 0.001），見圖4。

圖4 TUNEL法測定各組細胞凋亡情況比較×400Fig.4 Apoptosis was determined among the three groups by TUNEL assay ×400

3 討論

本研究以IRI后小鼠作為AKI動物模型來研究槐耳對AKI-CKD作用。造模采用常用的雙側腎臟缺血再灌注模型，結果顯示，IRI后腎功能隨著時間延長逐漸恢復，術后28 d時血肌酐接近正常值，但HE、Masson染色結果和血清NGAL水平升高說明腎臟損傷及間質纖維化仍十分明顯。IRI+Huaier組血肌酐水平較IRI組下降，說明槐耳可保護AKI后腎功能；28 d時HE、Masson染色結果顯示腎臟損傷及纖維化程度較IRI組減輕，說明槐耳可以減輕AKI后腎損傷及纖維化程度。

最近，研究［10］指出腎臟近曲小管的ERS在IRI損傷導致的AKI后腎纖維化過程中持續存在，參與腎臟纖維化的發生發展，持續的ERS可引發凋亡［11］，GRP78表達于細胞質，是ERS的標志性蛋白之一，當內質網功能紊亂時，非折疊蛋白在內質網腔內堆積，致使GRP78與PERK、ATF6、IRE1分離，GRP78表達增高是 ERS 發生和存在的標志［12］，CHOP主要表達于細胞核，是轉錄因子家族 C/EBP的成員之一，在正常生理情況下表達極低，而當發生過度的ERS時其表達顯著被誘導，調控下游細胞凋亡相關基因表達［13］。XU等［14］在UUO模型中發現ERS活化并能促進腎臟纖維化。

研究［15］顯示，槐耳通過刺激細胞因子釋放和產生活性氧、一氧化氮來調節先天免疫，潛在的不良反應是惡心和嘔吐。槐耳浸膏對順鉑誘導的小鼠AKI具有保護作用，可能機制是通過抑制腎小管上皮細胞炎癥、凋亡發生而實現［7］。槐杞黃（槐耳為主要成分）可通過抑制ESR，抑制足細胞GRP78 和CHOP表達，保護高糖誘導的小鼠足細胞損傷，降低細胞凋亡［8］。目前尚無槐耳在AKI-CKD轉變過程中的作用及機制研究。參照既往藥物干預AKI-CKD轉變的相關研究［16］，本研究發現IRI組內質網相關分子GRP78和CHOP表達較Sham組明顯升高，提示AKICKD進展過程中，ERS參與腎臟纖維化損傷的過程，與SHU等［17］研究結果一致。此外，本研究結果顯示槐耳治療顯著減少了細胞凋亡，保護了IRI誘導的腎小管細胞，推測這種保護作用是通過抑制ERS和凋亡介導的。FANG等［18］發現槐耳通過減少順鉑誘導的腎臟損傷和凋亡來改善腎功能，與本研究結果一致。

綜上所述，槐耳能夠改善AKI后腎纖維化小鼠腎功能，延緩腎損傷及腎間質纖維化進程，其機制可能是通過抑制ERS和凋亡實現的。槐耳不良反應小，對腎臟有著強大的保護作用，它在AKI-CKD轉變過程中的其他作用機制還需進一步研究探索，以便為腎纖維化的治療提供新的思路。