羅非魚皮膠原蛋白肽-鋅螯合物的制備及結(jié)構(gòu)表征與體外消化分析

柯梟，胡曉，楊賢慶，陳勝軍，吳燕燕，薛長(zhǎng)湖，李來(lái)好*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266003)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300)

羅非魚是一種廣泛養(yǎng)殖的淡水魚，目前羅非魚工業(yè)化產(chǎn)品主要為魚片，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物,如頭部，內(nèi)臟，骨骼，魚皮和魚鱗。其中魚皮含有豐富的膠原蛋白，可作為生物活性肽的理想原料。膠原蛋白具有特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列呈現(xiàn)(G-X-Y)n周期性排列，G為甘氨酸，X多為脯氨酸[1]。因其含有豐富的甘氨酸和脯氨酸，因此具備良好的鋅離子螯合能力的潛質(zhì)[2-3]。本研究選用羅非魚皮為原料，以期得到良好生物活性的螯合物。

鋅是一種體內(nèi)快速轉(zhuǎn)換的微量元素，由于人體缺乏鋅儲(chǔ)存功能，因此每天需要從飲食中獲得攝入量的20%～40%，以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[4]。鋅在結(jié)構(gòu)、催化和調(diào)節(jié)3個(gè)方面發(fā)揮重要作用[5]，缺鋅可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病和衰老等慢性疾病[6]。傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)鋅補(bǔ)充劑和有機(jī)鋅補(bǔ)充劑與胃酸或者食物中的草酸結(jié)合易形成沉淀[7]，導(dǎo)致鋅的生物利用率較低[8]。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、安全且易吸收的鋅離子補(bǔ)充劑至關(guān)重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，多肽與鋅離子形成可溶性螯合物，這種螯合物以整體的形式被消化吸收，能夠有效地阻止鋅在胃腸道中形成沉淀[9-11]。

本研究以羅非魚為原料，分別用堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶提取膠原蛋白肽，以鋅離子螯合率為指標(biāo)，篩選出最佳活性的膠原蛋白肽。通過(guò)高效液相色譜對(duì)其分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定，并借助線性擬合來(lái)探究分子質(zhì)量分布與鋅離子螯合率的相關(guān)性。運(yùn)用紫外光譜和傅里葉紅外光譜對(duì)其螯合位點(diǎn)進(jìn)行探究，通過(guò)掃描電鏡和原子力顯微鏡觀察螯合前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。此外采用體外模擬胃腸道消化模型評(píng)估肽-鋅螯合物的生物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮，廣東百維生物科技有限公司；堿性蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胃蛋白酶，酷爾化學(xué)科技有限公司；硫酸鋅，合肥巴斯夫生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽(307.3 Da)、氧化型L-谷胱甘肽(612.63 Da)、桿菌肽(1 422.69 Da)、抑肽酶(6 511.44 Da)和細(xì)胞色素C(12 400 Da)，北京睿博興科生物技術(shù)有限公司；以上試劑均為分析純。乙腈和三氟乙酸(色譜純)，Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Titrando-809型自動(dòng)電位滴定儀，瑞士萬(wàn)通公司；KjeLtecTM-2300型蛋白自動(dòng)分析儀，丹麥福斯分析儀器公司；THZ-C型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)華美生化儀器廠；ALpha1-4型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；AvantiJ26XP型高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；LC-20AD高效液相色譜儀、IRAffinity-1型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜，美國(guó)安捷倫公司；SU1510 型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Dimension-Icon 原子力顯微鏡，德國(guó)布魯克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠原蛋白肽制備

根據(jù)ZHANG等[12]方法略做修改。將羅非魚皮切成1 cm×1 cm的小片，用2 g/L NaOH溶液(1∶10，g∶mL)溶液浸泡30 min以除去雜蛋白和色素，隨后用蒸餾水沖洗直至pH=7。然后用2 g/L HCl 溶液浸泡15 min使其發(fā)生溶脹，并用蒸餾水沖洗直至pH=7。最后，將其在恒溫水浴鍋內(nèi)40 ℃振蕩5 h進(jìn)行熱提，經(jīng)4 900×g離心20 min，上清液即為膠原蛋白溶液。

將獲得的膠原蛋白溶液，分別用堿性蛋白酶，復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶在最適溫度和pH下進(jìn)行酶解，料液比1∶10，加酶量為0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，結(jié)束后放沸水浴15 min 終止反應(yīng)。經(jīng)冷凍干燥，得到膠原蛋白肽的凍干粉。

1.3.2 水解度的測(cè)定

原料中總氮含量M1(g)均采用半微量凱氏定氮法測(cè)定；膠原蛋白肽的氨基態(tài)氮含量M2(g)采用甲醛電位滴定法測(cè)定。水解度計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.3 鋅離子螯合率的測(cè)定

根據(jù)ZHANG等[13]的方法并作適當(dāng)修改。5 mg/mL膠原蛋白肽與5 mmol/L ZnSO4溶于20 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH 5.0)，在37 ℃螯合反應(yīng)30 min。用分子質(zhì)量100 Da的截留袋透析去除未螯合的鋅離子，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)螯合鋅含量。

1.3.4 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

使用凝膠色譜法在TSKgel G2000 SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm，5 μm)對(duì)堿性蛋白酶酶解6 h下的膠原蛋白肽進(jìn)行分子質(zhì)量分布的測(cè)定。將樣品配制成2 mg/mL，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，裝入棕色液相小瓶并裝載到液相，液相條件：流動(dòng)相A：含有0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸的超純水；流動(dòng)相B：含有0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸的乙腈；等度洗脫：20% B；流速：0.5 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。選取5種標(biāo)準(zhǔn)品：谷胱甘肽還原(307.3 Da)，L-谷胱甘肽氧化(612.63 Da)，桿菌肽(1 422.69 Da)，抑肽酶(6 511.44 Da)和細(xì)胞色素C(12 400 Da)，以保留時(shí)間為X軸，lg(MW)為Y軸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.221x+6.879 4 (R2=0.995 6)。

1.3.5 螯合物的制備

將膠原蛋白肽與ZnSO4溶于20 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH 5.0)，在37 ℃螯合反應(yīng)30 min。用分子質(zhì)量100 Da的截留袋透析去除未螯合的鋅離子，將截留溶液冷凍干燥，得到螯合物白色粉末，備用。

1.3.6 螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.3.6.1 紫外光譜

將膠原蛋白肽溶解于去離子水(0.1 mg/mL)，然后加入不同濃度的ZnSO4溶液(0、50、100、200 mmol/L)進(jìn)行螯合。以去離子水完成空白校準(zhǔn)，紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)掃描波長(zhǎng)范圍為190～260 nm。

1.3.6.2 傅里葉變換紅外光譜

將1 mg的肽和螯合物凍干粉分別與100 mg 干燥的KBr在瑪瑙研缽中混合均勻，充分研磨至顆粒達(dá)到約2 μm，將混合物均勻放置在固體壓膜模具，在8 T/cm2左右壓力下保持1～2 min，得到透明的錠片。取出錠片，進(jìn)行IRAffinity-1型傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)，通過(guò)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6.3 掃描電鏡

將肽和螯合物凍干粉配制成溶液，均勻涂在樣品架的玻璃片上并進(jìn)行噴金處理，通過(guò)掃描電鏡對(duì)肽和螯合物進(jìn)行表面形態(tài)分析。

1.3.6.4 原子力顯微鏡

將肽和螯合物凍干粉用超純水配制成0.5 mg/mL，在室溫下用氮?dú)鈱悠蜂佌乖谠颇钙砻嫔稀２捎幂p敲模式，利用原子力顯微鏡分析肽和螯合物的表面形態(tài)。

1.3.7 模擬體外胃腸道消化

根據(jù)WANG等[14]方法略做修改。用0.1 mol/L HCl(pH 2.0)將肽-鋅螯合物和ZnSO4配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL，加入胃蛋白酶(酶與底物的質(zhì)量比為1∶50)模擬胃部環(huán)境，將混合物于37 ℃水浴振蕩2 h。模擬胃消化后，添加1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至7.5使胃蛋白酶失活。隨后，向溶液中加入胰蛋白酶(酶與底物的質(zhì)量比為1∶25)模擬腸道環(huán)境，并在37 ℃水浴振蕩2 h。模擬胃腸道消化結(jié)束，消化液在沸水浴加熱15 min以終止酶解。

肽-鋅螯合物的穩(wěn)定性評(píng)估：使用液相色譜法在Althena C18-WP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，CNW Technologies)上對(duì)胃部消化、腸液消化后的消化液進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估肽-鋅螯合物的穩(wěn)定性。將消化液在12 000 r/min離心10 min，然后取上清液經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，裝入棕色液相小瓶并裝載到液相。液相條件設(shè)置如下：流動(dòng)相A：含有0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸的超純水；流動(dòng)相B：含有0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸的乙腈；洗脫梯度：90%～50% B，0～10 min;50%～10% B，10～18 min;10%～90% B，18～20 min；流速：0.5 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。

溶解率測(cè)定：分別取胃部消化、腸液消化后的消化液測(cè)定肽-鋅螯合物和ZnSO4的溶解率。將溶液在12 000 r/min離心10 min。利用ICP-MS分別測(cè)定上清液中鋅離子和溶液中總鋅濃度。鋅離子溶解率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：ρ1為上清液中鋅離子的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ2為等體積溶液中鋅離子的質(zhì)量濃度，μg/L。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)通過(guò)Excel軟件整理，Origin 2018軟件作圖，SPSS 19.0軟件Duncan′s Multiple-Range Test方法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白肽的水解度

由圖1可知，隨著時(shí)間推移，酶解反應(yīng)進(jìn)行得越充分，水解程度越高。在0～4 h，水解度呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，可能與此時(shí)酶活力較高和酶切位點(diǎn)較多有關(guān)。4 h之后，隨著底物濃度的限制和酶切位點(diǎn)減少，水解度變化趨于平緩。堿性蛋白酶酶解的膠原蛋白肽水解度在7 h達(dá)到最高24.95%，同樣，復(fù)合蛋白酶酶解的膠原蛋白肽水解度在8 h達(dá)到最高21.54%。相比而言，胰蛋白酶酶解的膠原蛋白肽水解度較低。研究表明[8]，相比于高分子質(zhì)量肽，低分子質(zhì)量肽往往具有更好的生物活性。堿性蛋白酶由地衣芽孢桿菌發(fā)酵制備，作為一種絲氨酸型的內(nèi)切蛋白酶，對(duì)蛋白水解效果顯著[15]。復(fù)合蛋白酶由米曲霉菌株發(fā)酵生成，同時(shí)具有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶2種酶的活性，水解蛋白效果顯著[16]。每種蛋白酶具有不同的酶切特異性，對(duì)肽鍵的破壞程度不同，導(dǎo)致水解度的差異[17]。綜上所述，堿性蛋白酶對(duì)膠原蛋白的水解程度較高，一定程度表明堿性蛋白酶更有助于產(chǎn)生更多的生物活性肽。

2.2 膠原蛋白肽的鋅離子螯合率

由圖2可知，膠原蛋白肽的鋅離子螯合活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但是三者之間存在顯著性差異，其中經(jīng)堿性蛋白酶酶解制備的膠原蛋白肽-鋅離子螯合率最佳，顯著高于復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶(P<0.05)。經(jīng)堿性蛋白酶酶解6 h制備的膠原蛋白肽螯合率最高，達(dá)到0.075 μmol/mg。堿性蛋白酶由多種不同的蛋白酶組成，能產(chǎn)生更多的活性位點(diǎn)[18]；經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解2 h獲得的膠原蛋白肽螯合率最佳，達(dá)到0.040 μmol/mg；而經(jīng)胰蛋白酶酶解4 h 獲得的膠原蛋白肽螯合率最佳，達(dá)到0.020 μmol/mg。HOU等[19]發(fā)現(xiàn)太平洋鱈魚骨肽鈣離子螯合率最高達(dá)到0.040 μmol/mg。綜合水解度指標(biāo)和鋅離子螯合率的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解6 h獲得的膠原蛋白肽具有最佳鋅離子螯合活性，且酶解程度充分，故將該樣品作為后續(xù)螯合物的原料。

2.3 膠原蛋白肽的分子質(zhì)量分布

根據(jù)前人的報(bào)道，分子質(zhì)量與鋅離子螯合率的關(guān)系是不確定的。WANG等[8]報(bào)道稱從芝麻酶解物分離出的低分子質(zhì)量肽(<500 Da)鋅離子螯合活性優(yōu)于高分子質(zhì)量肽(>500 Da)。另外，CHEN等[20]研究發(fā)現(xiàn)從牡蠣酶解物獲得的高分子質(zhì)量肽更易與鋅離子發(fā)生螯合反應(yīng)。因此，本研究對(duì)堿性蛋白酶不同酶解時(shí)間制備的膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定，并與鋅離子螯合率進(jìn)行線性擬合。由圖3可知，隨著酶解過(guò)程的進(jìn)行，膠原蛋白肽的高分子質(zhì)量組分向低分子質(zhì)量的轉(zhuǎn)化。酶解前期(0～120 min)分子質(zhì)量分布變化明顯，酶解后期(360～480 min)時(shí)，其分子質(zhì)量分布情況基本保持不變。該發(fā)現(xiàn)與前面水解度的結(jié)果保持一致，酶解前期水解度大，會(huì)發(fā)生更多向低分子質(zhì)量肽的轉(zhuǎn)化。由圖4可知，膠原蛋白肽200～500 Da的組分在逐步上升，從25.22%增長(zhǎng)到48.69%，而1 000～3 000 Da的組分在明顯下降，從33.10%下降到10.14%。由圖5可知，線性擬合分析發(fā)現(xiàn)200～1 000 Da的組分與鋅離子螯合率呈正相關(guān)性(r=0.96，P<0.05)。綜上，這些結(jié)果表明羅非魚皮膠原蛋白肽的分子質(zhì)量對(duì)鋅離子螯合活性有顯著影響，且低分子質(zhì)量肽更易與鋅離子發(fā)生螯合反應(yīng)。

2.4 肽-鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 紫外掃描分析

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

2.4.3 電鏡分析

由圖8可知，膠原蛋白肽和肽-鋅螯合物電鏡圖有明顯區(qū)別，膠原蛋白肽的表面光滑，呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)。與鋅離子螯合之后，膠原蛋白肽和鋅形成橋連，螯合物呈現(xiàn)粗糙的球狀顆粒聚集體形態(tài)。螯合物表面附著白色晶體，這應(yīng)該是吸附在膠原蛋白肽上的鋅晶體。該發(fā)現(xiàn)與原洪等[24]，劉閃等[25]發(fā)現(xiàn)螯合物表面附著白色晶體的結(jié)論一致。掃描電鏡結(jié)果從微觀表面形態(tài)的角度同樣證明螯合物的產(chǎn)生。

2.4.4 原子力顯微鏡分析

由圖9可知，膠原蛋白肽與肽-鋅螯合物的分子表面形態(tài)和納米分辨率級(jí)別的粗糙度。膠原蛋白肽平均粗糙度9.67 nm，而肽-鋅螯合物平均粗糙度 3.12 nm。膠原蛋白肽的表面圖像顯示相對(duì)均勻的納米級(jí)顆粒(圖9-a)，其中單個(gè)分散體3D圖像(圖9-b)更加直觀的顯示該特性。與鋅離子螯合之后，螯合物顯示不同形狀的簇，其3D圖像也可以明顯看出，可能由多肽與鋅離子螯合導(dǎo)致。螯合物呈現(xiàn)不同聚集體的發(fā)現(xiàn)與電鏡結(jié)果一致。該結(jié)果與CUI等[26]發(fā)現(xiàn)海參卵肽結(jié)合鈣離子之后表面形態(tài)發(fā)生變化的結(jié)果類似。這與上述實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果達(dá)成一致。

2.5 肽-鋅螯合物生物利用率分析

由圖10可知，肽-鋅螯合物經(jīng)過(guò)胃腸道消化后，液相色譜圖出峰時(shí)間均在4～8 min，沒(méi)有發(fā)生明顯變化。該結(jié)果表明，肽-鋅螯合物保持了一定的穩(wěn)定性。觀察胃部消化，腸道消化后，肽-鋅螯合物吸收峰形變化，胃部消化后峰形相對(duì)穩(wěn)定，最大吸收峰吸光值略微降低，而腸道消化后，峰形變化更加明顯，且最大吸收峰吸光值下降更多。根據(jù)該結(jié)果，推測(cè)肽-鋅螯合物在胃部消化后能夠保持良好的穩(wěn)定性，而在腸道消化后會(huì)發(fā)生部分分解。該結(jié)果表明螯合物的螯合結(jié)構(gòu)幾乎不受胃蛋白酶的影響，而胰蛋白酶對(duì)結(jié)構(gòu)具有部分破壞作用。類似的結(jié)果發(fā)生在芝麻肽-鋅螯合物能夠抵抗胃部分解，但在腸道會(huì)發(fā)生部分分解[27]。

由圖11可知，肽-鋅螯合物經(jīng)過(guò)胃部消化和腸道消化后的溶解率分別為96.10%，68.03%，而ZnSO4經(jīng)過(guò)胃腸道消化為88.31%，39.93%，結(jié)果表明在整個(gè)胃腸道消化階段螯合物的鋅離子溶解率均顯著高于無(wú)機(jī)鋅(P<0.05)。螯合物在胃部表現(xiàn)出良好的鋅離子溶解率，主要原因是螯合結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生破壞(圖10)，鋅離子與多肽作為一個(gè)整體存在。螯合物在腸道的溶解率明顯下降，可能是螯合結(jié)構(gòu)在腸道階段發(fā)生部分分解(圖10)，被分解鋅離子在腸道的堿性環(huán)境下易形成沉淀[28]。綜上，相比于無(wú)機(jī)鹽，螯合物在胃腸道消化階段能夠一定程度保持其完整的螯合結(jié)構(gòu)，避免了無(wú)機(jī)鋅在胃腸道易于形成沉淀的問(wèn)題，有效地提高了鋅離子的生物利用率。

3 結(jié)論

本文對(duì)膠原蛋白肽的分子質(zhì)量分布與鋅離子螯合活性的關(guān)系進(jìn)行探究，并對(duì)螯合前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，隨后通過(guò)模擬胃腸道模型探究螯合物的生物利用率。結(jié)果表明，低分子質(zhì)量的膠原蛋白肽更易與鋅離子發(fā)生螯合作用；鋅離子螯合后，膠原蛋白肽的表面形態(tài)發(fā)生變化，其螯合位點(diǎn)為酰胺鍵，氨基的氮原子和羧基的氧原子；相比于無(wú)機(jī)鹽，螯合物在胃腸道消化階段能夠一定程度保持其完整的螯合結(jié)構(gòu)，避免了無(wú)機(jī)鋅在胃腸道易于形成沉淀的問(wèn)題，有效地提高了鋅離子的生物利用率。