敲除mig1基因對馬克斯克魯維酵母利用葡萄糖和木糖的影響

李俊毅，王大紅,2,3*，蘇佳杰，姬翔，李陽,2,3*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽， 471023)2(河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽， 471023) 3(河南科技大學，微生物資源開發與利用校級重點實驗室，河南 洛陽，471023)

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)作為一種食品安全級酵母[1-2]，具有耐熱性強、生長快、可利用的底物范圍廣等特點[3-5]，被越來越多的研究人員用于構建微生物細胞工廠[6]，成為潛在的工業生產應用菌[7]。相較于釀酒酵母，馬克斯克魯維酵母不僅能夠利用葡萄糖，還擁有完整的木糖和阿拉伯糖代謝酶系統[8-9]。木糖進入酵母細胞后，首先在木糖還原酶和還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的作用下生成木糖醇，而后在木糖醇脫氫酶和輔酶NAD+的作用下形成D-木酮糖，最后在木酮糖激酶的催化下合成木酮糖-5-磷酸，繼而進入五碳糖磷酸途徑和糖酵解途徑。因此，馬克斯克魯維酵母具有利用木質纖維素類生物質生產生物燃料和生物基化學品的潛力[10]。然而木質纖維素類生物質通常是混合碳源，由于葡萄糖效應的存在，其他碳源尤其是木糖的代謝會被抑制，導致其利用效率的下降[11]。因此，進行馬克斯克魯維酵母葡萄糖效應方面的研究對于解決其葡萄糖、木糖共利用的問題具有積極意義。

目前釀酒酵母的葡萄糖效應研究基礎較好[12]。mig1基因作為葡萄糖轉錄負調控中的關鍵因子，其編碼的蛋白MIG1具有C2H2鋅指結構，可在葡萄糖的作用下與多個基因的啟動子結合，從而抑制基因的轉錄[13]。在無葡萄糖或葡萄糖含量很低時，MIG1蛋白不再結合到相關基因的啟動子上，解除阻遏基因轉錄的抑制。因此，通過敲除釀酒酵母mig1基因的方式可以有效地解除其葡萄糖效應。與釀酒酵母相比，目前馬克斯克魯維酵母中葡萄糖效應相關的研究較少，其葡萄糖對木糖代謝抑制的機理研究還不明確。結合馬克斯克魯維酵母基因組中存在釀酒酵母MIG1蛋白同源基因mig1(GenBank ID:34714544)，本研究擬將出發菌株LJ0的mig1基因敲除，并對野生型菌株和敲除菌株的葡萄糖、木糖以及混合糖利用能力進行檢測評價，研究其對馬克斯克魯維酵母葡萄糖效應和對利用不同碳源發酵的影響，具有較大的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養基

出發菌株：K.marxianus菌株LJ0由本校微生物基因工程研究室保藏。

YPD培養基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，葡萄糖20。

篩選培養基：潮霉素終質量濃度為100 μg/mL的YPD培養基。

發酵培養基(g/L)：酵母浸粉10，蛋白胨20，一定濃度的葡萄糖(或木糖)。

1.1.2 主要試劑

逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，康為世紀生物科技有限公司；木糖、TaqDNA聚合酶、Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物藥業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1mig1基因的敲除

采用同源重組法[14-15]進行基因敲除研究，擬用編碼潮霉素基因hptII的CDS(蛋白質編碼區)替換基因組DNA中的mig1基因的CDS，過程見圖1。根據GenBank中K.marxianusDMKU3-1042菌株的基因組DNA序列設計引物，擴增mig1基因CDS上下游各500 bp的同源臂片段mig1a、mig1b，并利用重疊延伸PCR技術[16]將兩者與hptII的CDS序列構建拼接獲得同源重組敲除片段mig1a-hptII-mig1b。利用電轉化法[17]將敲除片段導入酵母細胞中，通過含有潮霉素的YPD平板篩選出敲除菌株，并進行hptII基因的PCR驗證。

1.2.2 敲除菌株的驗證

以敲除菌株的基因組DNA為模板，擴增抗性標記基因hptII進行PCR驗證，以原始菌株與敲除菌株的總RNA為模板，經逆轉錄后得到相應的cDNA。以得到的cDNA為模板，分別針對mig1基因進行熒光定量PCR驗證，內參基因為act1基因。每個樣品取3個重復根據2株菌株的循環閾值(cycle threshold，Ct)，計算平均值，依照RATE=2-ΔΔCt來計算相關基因的相對表達量，驗證菌株的mig1是否已經被敲除。

1.2.3 以不同碳源進行發酵

以不同濃度的葡萄糖、木糖以及不同比例的混合糖為碳源對野生型菌株和敲除菌株進行發酵，檢測mig1基因的敲除是否對利用不同碳源的發酵產生影響。

1.2.4 生長曲線的測定

將種子液接種到發酵培養基當中，每隔12 h取樣1次，對樣品進行適當稀釋，以無菌水作為參比，測定菌液在波長為600 nm時的吸光度，吸光度=稀釋倍數×OD600。

1.2.5 發酵液殘糖分析

利用DNS法[18]測定發酵液中還原糖的含量，利用葡萄糖測定試劑盒測定發酵液中葡萄糖的含量。

1.2.6 木糖代謝關鍵酶基因表達量的檢測

以40 g/L的木糖為碳源對原始菌株與敲除菌株進行發酵培養，分別提取總RNA為模板，針對木糖代謝關鍵酶木糖還原酶基因xyl1、木糖醇脫氫酶基因xdh、木酮糖激酶基因xks1進行熒光定量PCR分析。

2 結果與分析

2.1 敲除菌株的驗證

通過重疊PCR獲得同源重組片段mig1a-hptII-mig1b，電泳結果如圖2-a所示，片段大小與預期一致。從潮霉素篩選平板中挑取長勢良好的單菌落LJ37菌株后，提取基因組DNA擴增hptII基因，電泳結果如圖2-b所示，片段大小為1 026 bp，與預期一致，表明同源重組片段已成功整合到酵母基因組DNA中。提取野生型菌株和敲除菌株的基因組RNA，逆轉錄為cDNA后、利用熒光定量PCR檢測2株菌株的mig1相對表達量。結果顯示熒光擴增曲線圖中無法檢測出敲除菌株的mig1的信號，證明目的基因mig1并未表達，敲除菌株成功構建。

2.2 對葡萄糖利用的影響

以葡萄糖為碳源對野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37進行發酵。圖3為2株菌株利用不同濃度葡萄糖發酵的菌株生長曲線。當葡萄糖質量濃度為40 g/L時，敲除菌株LJ37最終生長量OD600為17.43，是野生型菌株LJ0的1.24倍。當葡萄糖質量濃度提升到80、120、160 g/L時，野生型菌株生長量有所提高，但達到的最大生長量基本一致，而敲除LJ37菌株的最大生長量可隨著糖濃度的增加繼續增加。在糖濃度達到160 g/L時，LJ37的生長量提升為原始菌株的1.17倍，盡管提升程度較低濃度發酵有所降低，但在糖濃度較高時敲除菌株能夠在12 h迅速生長到平臺期，達到最大生長量。在ZHANG等[19]的相關研究中，構建的mig1敲除菌株較親本葡萄糖抑制效應降低了49.88%，葡萄糖代謝能力得到顯著提高，與本文結果一致。同時根據其他相關研究[20-21]中的內容，mig1基因的敲除也能夠有效提高釀酒酵母、面包酵母菌株葡萄糖的利用速率和生物量。結果表明，敲除菌株LJ37可以適應更高濃度的葡萄糖，mig1基因的敲除有助于提高其在高濃度葡萄糖條件下的生長量，這對于馬克斯克魯維酵母高密度發酵的研究具有參考價值。

2.3 對木糖利用的影響

以木糖為碳源對野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37進行發酵，圖4為2株菌株在不同濃度木糖下生長的發酵曲線及殘糖變化曲線。在生長量方面，敲除菌株的整體生長量較原始菌株高。當木糖質量濃度為20 g/L時，2株菌株均達到最大生長量且此時2株菌株的生長量差距最大，較原始菌株生長量提高19.1%。當底物木糖質量濃度高于20 g/L時，2株菌株的生長量都會隨著底物碳源濃度的升高而降低，但敲除菌株的整體生長量仍高于野生型菌株。在XU等[22]通過構建mig1突變體提高釀酒酵母木糖利用率的研究中發現，mig1基因的敲除對木糖代謝途徑中多個關鍵基因相對表達量的提升有促進作用，與本文的實驗結果相一致。總體而言，相較于野生型菌株，敲除菌株LJ37的生長量隨著底物木糖濃度的增長變化更為明顯。

通過測定野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37在不同木糖濃度條件下發酵培養基中的殘糖濃度，進行木糖消耗量分析。當起始木糖質量濃度較低時(20～40 g/L)，2株菌株均能在48 h內將底物木糖基本全部利用，隨著初始底物中木糖含量的增加，敲除菌株在代謝速率上的優勢愈明顯。在此過程中，2株菌株均在木糖質量濃度為40 g/L、發酵12 h時達到最大糖利用速率，其中敲除菌株的最大糖利用速率達到2.44 g/(L·h)，為野生型菌株的1.6倍，提升較為明顯。結合2株菌株的生長情況得出，較于原始菌株，mig1基因的敲除除了提升菌株木糖的代謝能力外，對于底物木糖濃度的變化也更加敏感。當木糖質量濃度提升到60 g/L時，敲除菌株最終的木糖利用率達到86.2%，為野生型菌株的1.16倍，但此條件下2株菌株的整體木糖代謝速率差異明顯減小，可能是高底物濃度對于馬克斯克魯維酵母木糖代謝有負面影響。王亮[23]在針對馬克斯克魯維酵母高密度發酵條件的優化研究中也指出，當木糖質量濃度超過65 g/L時，酵母的生長量開始降低。以上結果表明mig1基因的敲除有利于馬克斯克魯維酵母木糖代謝能力提升，可能是基因敲除解除了部分木糖代謝途徑中關鍵酶基因的抑制作用。

2.4 對混合糖利用的影響

以不同比例葡萄糖、木糖的混合糖為碳源對野生型菌株LJ0和敲除菌株LJ37進行發酵。由于總糖濃度過高會影響滲透壓使酵母菌的生長受到抑制，本文選用混合糖中木糖含量為20 g/L，葡萄糖的添加量分別為20、40、60、80 g/L。圖5為2株菌株利用不同比例混合糖進行發酵的生長曲線。敲除菌株整體生長量較原始菌株高，隨著混合糖濃度的增大，菌株的生長量逐漸升高。當混合糖質量濃度為20～80 g/L時，LJ37達到最大生長量，OD600達到30.27，為原始菌株的1.19倍。

通過研究2株菌株發酵過程中總殘糖及葡萄糖殘糖的濃度變化，可以計算出葡萄糖、木糖的消耗情況。分別測定2株菌株不同比例混合糖發酵液中的總殘糖和葡萄糖殘糖濃度，經對比敲除菌株的糖利用率和糖利用速率均優于原始菌株，與利用純木糖進行發酵時的情況一致。其中混合糖質量濃度為20～80 g/L時差異最為顯著，如圖6-a所示。經過計算，2株菌株木糖殘糖變化趨勢見圖6-b，可以看出2株菌株在發酵初期基本不利用木糖，發酵前18 h內仍以葡萄糖為主要碳源進行生長，當18 h后葡萄糖基本消耗完全，2株菌株開始代謝木糖進行生長，在后續消耗木糖進行生長的階段中，敲除菌株LJ37的木糖代謝能力要強于原始菌株。另外，敲除菌株發酵底物中在12 h出現木糖逐漸減少的現象，但由于消耗的木糖量較少且并未在發酵初始就能夠利用木糖，因此無法認為敲除菌株具有同時代謝2種糖的能力，即敲除菌株的木糖代謝能力雖然得到提高，但并未出現葡萄糖和木糖共代謝能力提高的現象。

本研究中mig1基因的單敲除未能真正有效解除葡萄糖的抑制效應，推測葡萄糖阻遏效應的解除可能同時受到多個轉錄因子的共同調控。蔡艷青等[25]研究發現，釀酒酵母中mig1基因的敲除對于混合糖發酵中的木糖代謝并沒有明顯促進作用，原因可能是由于在葡萄糖效應中mig1還受到另一個關鍵因子snf1的負調控，需要進一步敲除snf1才可解除葡萄糖對次級碳源的阻礙作用。盧敏[11]對于馬克斯克魯維酵母混合糖共利用菌株構建的研究指出，由己糖激酶基因Hxk介導產生的葡萄糖磷酸化信號對于SNF1形成蛋白復合體以及后續MIG1蛋白的磷酸化起到調控作用，導致非葡萄糖碳源部分代謝基因的轉錄受到抑制，并通過敲除KmHxk基因成功解除了葡萄糖的抑制效應，但Hxk作為葡萄糖代謝通路的關鍵基因，敲除會導致葡萄糖代謝的嚴重缺陷，菌株將無法繼續利用葡萄糖。由于目前針對馬克斯克魯維酵母的葡萄糖抑制效應的研究相對較少，后續實驗仍需要進一步對葡萄糖效應的其他調控因子和解除葡萄糖阻遏的其他方式進行研究。

2.5 木糖代謝關鍵酶基因表達量的檢測

以木糖為唯一碳源時，當木糖質量濃度為40 g/L，發酵12 h時木糖代謝速率達到最大值。為了在基因轉錄水平揭示mig1基因的敲除對于木糖代謝途徑中關鍵酶的影響，在該發酵條件下分別檢測野生型菌株和敲除菌株3個關鍵基因木糖還原酶基因xyl1、木糖醇脫氫酶基因xdh、木酮糖激酶基因xks1的相對表達量。圖7為2株菌株關鍵基因相對表達量差異圖。以木糖為碳源時，敲除菌株LJ37基因xyl1、xdh、xks1的相對表達量是野生型菌株的2.25、2.43、2.00倍。3種關鍵酶基因的相對表達量較野生型菌株均有一定程度的提升，證明mig1基因的敲除有利于提高3種關鍵酶基因的轉錄水平。在蔡艷青等[25]對釀酒酵母轉錄組的分析研究中指出，mig1敲除菌株中上調表達的基因中有部分與色氨酸的降解、精氨酸的吸收以及甘氨酸的代謝相關，這些基因可能直接或間接受到mig1基因的控制。這些氨基酸作為檸檬酸循環的關鍵中間代謝物對總反應中還原型輔酶I(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)的合成起到了關鍵作用，進而影響NADH作為輔酶在木糖代謝中催化木糖醇轉化為D-木酮糖的過程，加快了木糖進入細胞后的催化過程，使得關鍵酶基因的表達量得到提高。

3 結論

本文以馬克斯克魯維酵母LJ0為出發菌株，通過同源重組法敲除mig1基因，構建了敲除菌株LJ37，通過檢測2株菌株在不同碳源下的發酵性能，找出敲除mig1對于馬克斯克魯維酵母利用不同碳源的影響。實驗結果表明，mig1基因的敲除對于葡萄糖和木糖條件下菌株發酵的最大生長量均有所提升。在木糖發酵過程中，敲除菌株的生長量提升為野生型菌株的1.19倍，最大生長速率提升到2.44 g/(L·h)，為野生型菌株的1.6倍。在葡萄糖發酵過程中生長量提升則更為明顯，敲除菌株的最大生長量提升為野生型菌株的1.24倍。但在混合糖發酵中2株菌株的代謝糖能力差異較小，發酵過程中木糖的消耗速率差別不大，說明mig1基因的敲除并未完全解除葡萄糖的抑制效應。在對木糖代謝關鍵酶基因的測定結果方面，發現敲除菌株在木糖發酵條件下的部分關鍵酶基因的表達量得到提高，進一步確認了mig1基因的敲除有利于促進馬克斯克魯維酵母對于木糖的利用。總體而言，mig1基因的敲除對于混合糖發酵的影響不明顯，但是提高了菌株利用葡萄糖和木糖的能力。此外敲除菌株除了在葡萄糖發酵中代謝能力得到有效提高，還能夠利用較高濃度葡萄糖進行生長，在高密度發酵方面具有一定的潛力。