NaCl處理對養殖大黃魚肌原纖維蛋白風味吸附及結構的影響

胡遠輝，呂春霞，廖慧琦，陸益鋇，雷葉斯，張慧恩，曹少謙，楊華

(浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波，315100)

大黃魚肉質鮮美，脂肪含量低，蛋白含量高，營養豐富，深受消費者的喜愛。肌原纖維蛋白是大黃魚魚肉的重要組成部分，占魚肉蛋白的55%～60%[1]。在魚肉制品加工中，影響魚肉口感和品質的主要是肌肉蛋白質，肌原纖維蛋白又是肌肉蛋白質的主要組分，因此肌原纖維蛋白結構變化對魚肉制品品質有重要影響[2-3]。風味是十分重要的感官性質，是影響消費者選購肉制品的重要因素之一[4]。水產品的風味主要包括揮發性化合物氣味和非揮發性化合物，其中揮發性成分復雜，種類繁多，對魚肉整體風味起著重要的作用[5]。陳麗麗等[6]對6種不同水產品種魚露的風味化合物進行測定，其中醇類、酯類和酸類化合物所占的比例最大。常海軍等[7]研究發現臘肉的特征性揮發風味成分主要來自于酚類、醇類、醛類等。在肉類食品中醇、醛、酮、酯四類化合物是典型的風味物質，其與蛋白質基質緊密結合，對產品風味的改變具有決定作用。目前，肉品風味研究主要集中于對特征風味化合物的分離鑒定及加工中特征風味物質的積累，而對揮發性風味化合物在食品中的被吸附作用研究較少[8-10]。

NaCl是肉制品中重要的添加物之一，它不僅能增強食品的滋味，延長保質期，提供鈉源，而且對風味物質在蛋白中的吸附作用有重要影響[11-13]。FLORES等[14]在研究干腌肉制品中不同腌制劑對風味物質釋放的影響中發現NaCl是對其影響最大的物質。NAWAR等[15]認為鹽溶液中離子與水分子發生水合作用，使風味成分與水分子的結合減少，促進風味釋放；溫欣榮等[16]研究發現，隨著NaCl添加量的升高，哈爾濱風干腸中醛類化合物的含量升高，而醇類、酮類、酯類化合物的含量降低。有研究發現在水溶液中添加鹽類物質會提高風味化合物在蒸汽相中的濃度，如隨著NaCl濃度的增大，β-乳球蛋白對安息香醛的吸附作用降低[17]。汪娟[18]研究發現己醛和壬醛通過疏水相互作用和氫鍵與大豆分離蛋白結合。

已有少量報道顯示肌原纖維蛋白對風味化合物的吸附作用[11]，但仍缺少系統的研究。目前，NaCl濃度對海產品中肌原纖維蛋白風味吸附能力的影響并未被清晰闡明，蛋白結構的變化是否對吸附能力起作用仍不清楚[10]。對蛋白質結構及其風味物質的吸附能力進行探究，對于改善食物的風味或減少異味都有著突出作用。

本實驗以養殖大黃魚為研究對象，選擇了12種典型的風味化合物(醇類、醛類、酮類、酯類)，通過研究不同濃度NaCl處理后肌原纖維蛋白結構、表面疏水性、巰基含量的變化，分析肌原纖維蛋白與風味化合物相互作用機制，以便為后期養殖大黃魚的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

養殖大黃魚,寧波路林市場；溴酚藍、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；Tris(分析純)，德國biotech公式；1-辛烯-3-醇、1-己醇、2-庚酮、己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸辛脂、丁酮、2-壬酮、2-甲基丁醛、辛醛、戊醛、1-辛醇、1-戊醇、1,2-丙二醇，優級純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

Forma-725超低溫冰箱，艾本德中國有限公司；J-26XP高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特；7230G 可見光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FC 型酶標儀，上海維城儀器有限公司；FSH-2A 可調高速勻漿機，上海維誠儀器有限公司；In Via-Reflex 拉曼光譜儀，法國Renishaw公司；固相微萃取裝置，美國Sigma公司；氣相色譜-串聯質譜聯用儀，美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

新鮮養殖大黃魚，將其清水沖洗，去頭，去尾，去骨，取肉。將魚肉置于絞肉機絞碎，于-20 ℃保藏，待用。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取

參照CHIN等[19]和JIANG等[20]的方法并適當修改，具體為：取魚糜，加4倍體積冰提取液(20 mmol/L，pH 7.5磷酸鈉緩沖液)，高速勻漿機均漿60 s(7 500 r/min)，將所得的勻漿液冷凍離心10 min(7 000 r/min，4 ℃)，除去上清液。重復3次。得到粗肌原纖維蛋白加入4倍體積冰洗液(0.1 mol/L NaCl溶液)，均漿60 s(7 500 r/min)，離心10 min，取沉淀。重復1次上述實驗，最后一次勻漿液用3層紗布過濾，以7 000 r/min冷凍離心10 min，沉淀置于塑料培養皿中，包保鮮膜，-40 ℃冷凍保藏。

1.2.3 肌原纖維蛋白濃度測定

取96孔板，將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL 加到孔中，再補充稀釋液到20 μL。加10 μL樣品于96孔板中，補充10 μl稀釋液到20 μL。再各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃恒溫搖床放置15～30 min,593 nm處測定其吸光度,標準曲線如圖1所示。

1.2.4 肌原纖維蛋白表面疏水性測定

依據CHELH等[21]的方法測定。用含不同濃度NaCl溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.0)制得蛋白質量濃度為4 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液。取200 μL 質量濃度為1 mg/mL的溴酚藍溶液到1 mL的肌原纖維蛋白溶液中，充分混勻，用磁力攪拌器攪拌10 min，然后常溫下以7 500 r/min的轉速離心15 min，取上清液(稀釋10倍后)，在波長為595 nm下測定吸收值A1。空白組以 Tris-HCl緩沖液在相同的條件下測得的吸光值A0,如公式(1)所示：

(1)

1.2.5 肌原纖維蛋白巰基含量測定

將蛋白溶解于含有不同NaCl濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.0)中，加入尿素，使其終質量濃度為6 mg/mL；再向混合液中添加20 μL(1.5 mg/mL)的二硝基苯甲酸，25 ℃下靜置5 min，412 nm測定吸光值，摩爾消光系數為13 600 mol/(L·cm)。巰基含量計算如公式(2)所示[22]：

(2)

式中:A為減去試劑空白后412 nm處蛋白吸光值；D為樣品蛋白稀釋倍數；C為蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.2.6 拉曼光譜

用含不同NaCl濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)的肌原纖維蛋白樣品采用拉曼光譜分析，參考曹錦軒等[23]的方法。將肌原纖維蛋白樣品均勻涂抹于載玻片上，選擇20倍長聚焦鏡頭對肌原纖維蛋白樣品進行聚焦。具體的條件：所用功率為12 mW，532 nm氬離子激光器，分辨率為1 cm-1，獲取的拉曼光譜范圍在150～2 100 cm-1，每個樣品測3次。

1.2.7 風味化合物制備

用適量1,2-丙二醇溶解風味化合物，用雙蒸水定容，使溶液中各物質終質量濃度為800 mg/kg，密封后置于-4 ℃冰箱備用。

1.2.8 NaCl濃度對肌原纖維蛋白吸附能力的影響

參照PéREZ等[11]與FLORES等[24]的方法并略作修改。用含不同濃度NaCl溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.0)配制蛋白溶液為4 mg/mL。取5 mL上述蛋白溶液于頂空瓶內，分別加入100 μL質量濃度為800 mg/kg醛類、酮類、酯類溶液，密封，勻速搖勻，4 ℃下冷藏吸附24 h。將冷藏吸附后的樣品置于25 ℃下平衡2 h后，采用75 μm CAR/PDMS萃取頭頂空吸附30 min。

氣相色譜-質譜條件[25]：萃取頭在 220 ℃下解析5 min，不分流進樣，以氦氣為載氣，用毛細管柱對風味成分進行分離。GC升溫程序：柱溫在35 ℃保持3 min，以3 ℃/min程序升溫至40 ℃，再以8 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。質譜離子源溫度為200 ℃，檢測電壓為0.9 kV，掃描質量范圍為45～600 mAU。采用外標法根據色譜圖的出峰時間和峰面積對12種風味物質進行定量定性。

肌原纖維蛋白吸附能力參照劉士健[26]的方法并略作修改，按公式(3)進行計算：

(3)

式中：Ac，空白溶液中某一種揮發性化合物的峰面積；As，樣品溶液某一種揮發性化合物的峰面積。

1.3 數據處理

每組試驗重復3次平行，采用Office、Origin軟件分析數據，SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl濃度對養殖大黃魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質表面疏水性可以反映其表面疏水性氨基酸的相對含量，同時在一定程度上也可以反映出蛋白質結構的變化[27-28]。由圖2可知，隨著NaCl濃度的升高，肌原纖維蛋白表面疏水性先上升后下降。未處理組的溴酚藍結合量為33.59 μg。當NaCl濃度為0.4 mol/L時，溴酚藍結合量最高，為67.18 μg。當NaCl濃度為0.8、1 mol/L時，溴酚藍結合量分別為23.42 和13.43 μg，均比未處理組低。0～0.4 mol/L濃度范圍內表面疏水性的增大，可能是由于NaCl的存在使蛋白結構展開，內部的疏水性基團暴露出來。趙亞南等[29]研究發現鴨肉肌原纖維蛋白前期表面疏水性的增大可能是由于NaCl的存在破壞了蛋白分子外部親水作用與內部疏水作用間的平衡。在NaCl濃度在0.6～1 mol/L范圍內，肌原纖維蛋白表面疏水性降低，可能肌原纖維蛋白的疏水基團被包埋進蛋白內部。孔保華等[30]研究發現隨著NaCl濃度的增大，鯉魚肌原纖維蛋白的表面疏水性下降顯著，繼續增大濃度，表面疏水性變化不明顯，可能是由于一定的離子強度可以增強肌原纖維蛋白的溶解性。

2.2 NaCl濃度對養殖大黃魚肌原纖維蛋白巰基含量的影響

巰基含量是蛋白結構變化的一個重要指標。由圖3可以看出，隨著NaCl濃度的升高，肌原纖維蛋白的巰基含量呈上升趨勢。未處理組，大黃魚肌原纖維蛋白巰基含量最低，為0.935 μmol/g，隨著NaCl濃度的升高，其巰基含量逐漸上升，1 mol/L時最高，達到1.703 μmol/g。曾淑薇等[31]研究發現隨著磷酸鹽含量的增加，草魚肌原纖維蛋白的巰基含量呈上升趨勢，磷酸鹽的加入使蛋白分子展開，二硫鍵斷裂形成巰基。李德陽等[32]研究NaCl對大菱鲆肌原纖維蛋白巰基含量的影響發現，隨著氯化鈉濃度的升高，巰基含量增多，可能是由于NaCl濃度逐漸增大使蛋白分子展開，二硫鍵斷裂形成巰基暴露在分子表面，促使蛋白巰基含量升高；且NaCl會增多肌原纖維蛋白的溶解度，使分子內部的巰基暴露在蛋白表面，巰基含量升高。

2.3 NaCl濃度對養殖大黃魚肌原纖維蛋白結構的影響

拉曼光譜是一種散射光譜，可以通過光譜分析分子結構，對于研究蛋白質的構象具有重要作用。蛋白的拉曼光譜圖可以顯示出苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸中的某些基團的特征譜帶，可以通過酰胺鍵及C—C骨架伸縮振動譜帶來獲得主鏈骨架與側鏈構象的信息，從而推測出蛋白質二級結構的變化[33]。如表1所示，在1 650～1 660 cm-1處表征的是α-螺旋結構，在1 665～1 680 cm-1處表征的是β-折疊結構，在1 660～1 665 cm-1處表征的是無規則卷曲[34]。不同濃度NaCl下肌原纖維蛋白的二級結構變化如圖4所示，本實驗中酰胺Ⅰ帶的范圍在1 650 cm-1左右，說明α-螺旋是蛋白的主要二級結構。隨著NaCl濃度的升高，其最大峰值顯著上移，說明α-螺旋含量不斷減少，而β-折疊、β-轉角結構及無規則卷曲相應增多，蛋白結構發生改變[35]。李德陽等[32]研究發現，NaCl濃度對肌原纖維蛋白的α-螺旋、β-折疊影響較大，隨著NaCl濃度的升高，大菱鲆肌原纖維蛋白的α-螺旋不斷下降，β-折疊的含量相對增大，而β-轉角結構及無規則卷曲無明顯變化，這與本實驗結果一致。

表1 激光拉曼光譜條帶指認表Tab 1 Raman bands identified in table

2.4 NaCl濃度對養殖大黃魚肌原纖維蛋白吸附能力的影響

由圖5可知，隨著NaCl濃度的增加，養殖大黃魚肌原纖維蛋白對酮類的吸附作用在降低。肌原纖維蛋白對丁酮的吸附能力隨著NaCl濃度的升高而降低。在0～0.4 mol/L范圍內，肌原纖維蛋白對2-庚酮的吸附能力降低，0.6 mol/L時，略有升高，之后下降。肌原纖維蛋白對2-壬酮的吸附能力在0～0.2 mol/L范圍內呈下降趨勢，在0.4 mol/L時，吸附能力最高。以上變化說明不同NaCl濃度影響肌原纖維蛋白對不同種酮類的吸附能力。本實驗中肌原纖維蛋白巰基含量隨NaCl濃度升高不斷增大，蛋白結構發生變化，穩定性降低，其可能導致蛋白對酮類化合物的吸附能力下降。

由圖6可知，NaCl降低了肌原纖維蛋白對醛類化合物的吸附能力，醛類化合物自由比例顯著上升(P<0.05)。未處理組中，肌原纖維蛋白對2-甲基丁醛、戊醛、辛醛的吸附能力分別為27.04%、57.58%、50.97%。隨著NaCl濃度的升高，肌原纖維蛋白對醛類的吸附能力不斷下降，在1.0 mol/L時，吸附能力分別達到12.24%、24.25%、24.85%。TAN等[36]研究發現，隨著醛類化合物碳鏈的增長，其沸點升高，氫原子數增多且形成更多的氫鍵，本實驗除了對照組中的戊醛的被吸附能力比辛醛大，其他濃度下的吸附作用都隨碳鏈的增長而增大。柳敏[37]研究發現NaCl濃度會改變肌原纖維蛋白對庚醛、壬醛的吸附能力。NaCl會改變肌原纖維蛋白的空間構型，使其對風味化合物的吸附作用減弱[38]。

由圖7可知，隨著NaCl濃度的增大，肌原纖維蛋白對醇類的吸附能力不斷發生變化，當NaCl濃度達到 0.8～1.0 mol/L時，其對醇類的吸附能力幾乎接近于零。在NaCl濃度為0～0.2 mol/L時，肌原纖維蛋白對己醇與1-辛烯-3-醇的吸附能力呈下降趨勢(P<0.05)，當濃度達到0.4 mol/L時，又略有上升(P<0.05)，分別為13.91%和27.61%。POLL等[39]發現在蘋果汁中添加NaCl后乙醇、乙醛、酯類的揮發程度增大，分別為空白組的4倍、1.75～3.50倍和1.75 倍。PéREZ等[11]發現添加了食鹽的豬肉肌原纖維蛋白和肌動蛋白對風味化合物的吸附能力減弱，揮發性化合物的自有比例上升。

由圖8可知，NaCl濃度對肌原纖維蛋白酯類吸附能力總體呈下降趨勢。與未處理組相比，肌原纖維蛋白對乙酸乙酯和乙酸辛酯吸附能力顯著降低(P<0.05)。未處理組的吸附能力分別為23.3%、37.33%，在0.2～1.0 mol/L范圍內，當濃度為0.6 mol/L時，肌原纖維蛋白對乙酸乙酯的吸附能力最高，為18.73%。當濃度為0.4 mol/L時，肌原纖維蛋白對乙酸辛酯的吸附能力最大，為33.93%。當鹽濃度較高時，肌原纖維蛋白對酯類風味物質的吸附能力變化不明顯。

3 討論

有研究發現，介質條件、蛋白構象和濃度、風味化合物性質等是影響肌原纖維蛋白對揮發性風味化合物吸附作用的重要因素[6]。NaCl是食品調味的重要添加劑之一，其離子強度對于肌纖維蛋白的吸附能力具有影響，不同種類的的鹽以及不同的濃度對于蛋白質的吸附能力作用程度不一樣[14,36]。本實驗結果表明，肌原纖維蛋白的表面疏水性隨NaCl濃度的升高先上升后下降，在0.4 mol/L時最大。巰基含量隨著NaCl濃度的增大不斷升高，通過拉曼光譜分析發現，隨著NaCl濃度的升高，肌原纖維蛋白的二級結構發生不同程度的變化。在本實驗中添加了NaCl組普遍降低了肌原纖維蛋白對酮類、醛類、醇類、酯類的吸附能力。這與劉士健[26]研究NaCl對鹽溶蛋白對風味化合物吸附能力的影響結果一致。KüHN等[40]認為添加了NaCl后蛋白與風味化合出現的解吸附現象是由于蛋白溶液中存在的大量氫鍵，使風味化合物與水之間的氫鍵減少，促使風味化合物釋放出來。且對于不同的風味化合物，NaCl濃度變化對其吸附能力的影響程度具有差異，比如對于醇類化合物，NaCl濃度的變化對己醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇的影響程度高于1-戊醇的影響。在相同NaCl濃度下，肌原纖維蛋白對1-辛烯-3-醇的吸附能力要大于1-戊醇、己醇和1-辛醇，可能是有于碳碳雙鍵的存在可以更加顯著地使風味化合物與蛋白結合。研究發現，某些特定的官能團可以影響蛋白質與風味化合物的結合能力[8]。相對于醇類化合物，肌原纖維蛋白對醛類化合物的吸附能力要顯著增大，這是由于醛類化合物可以與氨基酸的α-氨基反應，生成轉氨基反應中間產物席夫堿，故肌原纖維蛋白對醛類化合物的吸附能力有所增強[41]。隨著NaCl濃度的增大，肌原纖維蛋白對醛類、酮類化合物的吸附能力總體呈下降趨勢，在相同NaCl濃度下，肌原纖維蛋白對戊醛和辛醛的吸附作用大于2-甲基丁醛。肌原纖維蛋白對醛類物質的吸附能力與風味化合物碳鏈長度有關，這可能是因為風味化合物碳鏈越長，含有的氫鍵越多，其與蛋白質的結合能力越強[42-43]。韓裕睿[44]研究發現肌原纖維蛋白對2-戊醛的吸附作用大于2-甲基丁醛，這是由于2-甲基丁醛的側鏈具有較大的空間位阻，阻礙其與蛋白質的結合。酮類化合物中2-壬酮受到的影響最為明顯。李陽[45]研究發現，在相同NaCl含量處理后的肌球蛋白對己醇、1-辛烯-3醇、庚醛、己醛的吸附能力依次上升。本實驗中，當NaCl的濃度為0～0.4 mol/L時，肌原纖維蛋白對乙酸乙酯的吸附能力呈下降趨勢，濃度為0.8 mol/L時，其吸附作用增大，隨后又下降。而乙酸辛酯的被吸附作用在NaCl濃度為0～0.2 mol/L時呈下降趨勢，0.4 mol/L時上升，略小于對照組，在0.6～1.0 mol/L時，肌原纖維蛋白對乙酸辛酯的吸附能力大幅下降。劉士健[26]研究發現，在相同結構的酯類化合物中，其分子質量越大，蛋白質與酯類化合物的結合能力越強。此外，蛋白對酯類化合物的吸附能力還與靜電相互作用有關。在0.4及0.6 mol/L時吸附能力升高可能是由于靜電相互作用增強以及蛋白結構發生變化引起的。NaCl的添加可以導致魚肉結構不穩定，部分蛋白發生溶解、聚集，蛋白聚集體的微觀結構不同，影響到蛋白質之間的相互作用，改變肌原纖維蛋白的結構與構象。因此，隨著NaCl濃度的提高，肌原纖維蛋白的結構不穩定，減弱蛋白對風味化合物的吸附能力[37]。

4 結論

NaCl對肌原纖維蛋白表面疏水性、巰基含量具有顯著性影響，隨著NaCl濃度的增大，肌原纖維蛋白的表面疏水性先上升后下降，巰基含量持續增多，且肌原纖維蛋白的二級結構發生改變，α-螺旋減少，β-折疊增多。由于肌原纖維蛋白發生變性，改變了蛋白之間的相互作用，從而導致了肌原纖維蛋白對風味化合物吸附能力的改變。但肌原纖維蛋白與風味化合物的吸附作用機制尚未明確，后續研究中可深入探討蛋白質與風味化合物的結合位點、相互作用力等。本文研究肌原纖維蛋白對風味化合物的吸附能力對改善我國傳統魚肉制品風味品質，生產具有良好風味結合與釋放特性的產品有指導意義。