中國市售醬腌菜中生物胺含量分析

李梅，汪冬冬，唐垚，張其圣，陳功，趙磊，明建英，郭麗艷，李成康*

1(眉山市產品質量監督檢驗所，四川 眉山，620000)2(國家泡菜質檢中心，四川 眉山，620000)3(四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山，620000)

生物胺是一類低分子質量的含氮有機化合物，主要通過氨基酸脫羧形成。根據結構可劃分為脂肪族胺(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)、芳香族胺(酪胺、苯乙胺等)、雜環族胺(組胺、色胺等)。根據組成可分為單胺(組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺等)和多胺(精胺、亞精胺等)[1-3]。

發酵食品本身存在或發酵過程中污染面存在的含氨基酸脫羧酶的微生物，它們利用底物中的游離氨基酸脫羧產生生物胺[4]。由于發酵過程通常會導致微生物生長和游離氨基酸的產生，這為生物胺的積累提供了前提條件。常報道發酵肉、奶制品、魚產品和發酵蔬菜中生物胺含量偏高[5]。人體適量攝入生物胺能促進生長、增強代謝活力、清除自由基等，但攝入過多可能會引起惡心、頭痛和呼吸不適等不良反應[6-7]。

醬腌菜是一種以新鮮蔬菜為主要原料制成的蔬菜產品，添加或不添加香料，經鹽或食用鹽水處理而成，是我國生鮮蔬菜最基本和最主要的貯藏及加工方式[8]。在中國市場上商業化的醬腌菜主要包括四川泡菜、東北酸菜、辣白菜、冬菜、宜賓芽菜、現代工業泡菜、調味海帶等。根據主要加工特征，將醬腌菜分為強發酵、弱發酵和不發酵。以泡菜為代表的醬腌菜，目前仍以自然發酵為主，依賴于蔬菜表面的以乳酸菌為主的微生物，生物胺的產生不可避免[9-10]。

考慮到生物胺的毒理學意義以及發酵食品風險評估的數據支持，本研究的目的是闡明某些類型的醬腌菜是否是高含量生物胺來源，因為這與消費者飲食健康直接相關。因此，本文采用高效液相色譜法對全國299個醬腌菜樣品中的生物胺含量進行檢測，根據區域、蔬菜品種、工藝等特征分析生物胺差異，找出影響生物胺產生的主要影響因素。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

根據全國各地醬腌菜產量確定采購的相對數量，從線上平臺以及全國各地企業進行采樣，共收集到299個醬腌菜樣品，其中包裝樣品(n=139)來自四川、黑龍江、沈陽、山東、河北、廣東、吉林和天津。散裝的樣品(n=160)主要來自四川，是從家庭、農貿市場、餐館和四川工廠收集，包含現代工業泡菜樣品(n=51)。將包裝好的產品密封并在冷藏條件下或室溫下保存。在室溫下24 h內分析未包裝腌菜的樣品。根據發酵特性，將299個樣品分為強發酵類(n=77，東北酸菜、現代工業泡菜半成品)、弱發酵類(n=151，傳統四川泡菜、辣白菜、冬菜、宜賓芽菜等)、不發酵類(n=77，現代工業泡菜成品和調味海帶等)。各工藝醬腌菜特征及取樣量如圖1所示。

1.2 材料與試劑

組胺二鹽酸鹽(98%，histamine dihydrochloride，HIM)、腐胺(99.9%，putrescine，PUT)、苯乙胺(97.5%，2-phenylethylamine，PHE)、尸胺(98%，cadaverine，CAD)、色胺(≥97.5%，tryptamine，TRPM)、酪胺(≥98.5%，tyramine，TYM)、亞精胺(≥98%，spermidine，SPD)、亞精胺(≥98%，spermine，SPM)和1,7-二氨基庚烷(98%，internal standard，IS), 美國Sigma公司；丹磺酰氯(≥98%)，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈(色譜純)和甲醇(色譜純)，上海安譜科學儀器有限公司；丙酮、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氨水、乙酸銨和三氯乙酸等均為分析純試劑，成都市科隆化學品有限公司。

1.3 實驗儀器

LC-2030 高效液相色譜分析儀，日本島津儀器公司；HH-6 數顯恒溫水浴鍋，上海析達儀器有限公司；TGL-20bR冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；VORTEX-2 旋渦混合器，美國GENE公司；TP-214 分析天平，美國DENVER公司。

1.4 試驗方法

國內高校對水文與水資源工程專業學生的培養目標和要求，是能在水利、水務、能源、交通、城建、農林、環保、國土資源、教育等部門從事水文、水資源、水環境和水生態有關的勘測評價、規劃設計、預測預報與管理、教學與科學研究等工作，具有知識面寬、能力強、素質高、敢于創新、善于合作的高級專門人才。本科畢業論文的選題內容將是對學生專業業務水平的綜合考查以及走上工作崗位之前的再一次系統鍛煉，具有非常重要的意義。

1.4.1 生物胺標準溶液及內標配制

生物胺單標儲存液：準確稱量酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、腐胺、尸胺和組胺標準品0.01 g，用0.1 mol/L HCl溶液溶解后定容為1 mg/mL的標準儲備溶液，置于-20 ℃下儲存。

內標使用液的配制：準確稱取1,7-二氨基庚烷0.1 g，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋呈10 mg/mL的內標標準儲備溶液，使用時采用梯度稀釋至0.1 mg/mL，現用現配。

生物胺混標使用液：分別吸取各單標儲存液1 mL，用0.1 mol/L HCl溶液配制成100 μg/mL的混標液，備用。

1.4.2 生物胺提取和衍生

參考MORET等[11]和FRAS等[12]的方法，并進行優化。稱取10 g切碎研磨后的樣品置于離心管中，加入1.25 mL 1.0 mg/mL內標使用液和15 mL 0.1 mol/L HCl溶液進行混勻，振蕩提取30 min，4 000 r/min的轉速下離心20 min，得到上清液1，沉淀部分加入15 mL 0.1 mol/L HCl溶液進行混勻，振蕩提取30 min，4 000 r/min的轉速下離心20 min，得到上清液2，合并2次取得的上清液，用0.1 mol/L HCl溶液定容至50 mL。取1.0 mL上述溶液，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL飽和NaHCO3溶液和2.0 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液，于40 ℃ 下避光反應60 min，然后加入200 μL 100 mg/mL 脯氨酸溶液，漩渦1 min后于室溫避光放置15 min，然后加入0.4 g NaCl漩渦振蕩至NaCl完全溶解后加入1 mL 乙醚，渦旋振蕩30 s，待靜置分層后取上層有機相，重復萃取1次，合并兩次有機相。將有機溶劑于40 ℃水浴中揮干，然后用1.0 mL乙腈溶解殘留物，再用0.22 μm濾膜過濾待測。

1.4.3 高效液相色譜條件

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結果與分析

2.1 生物胺標曲及回收率

為了評估分析方法的性能，結果如圖2和表2所示。醬腌菜中8種生物胺峰型獨立，生物胺的線性范圍為0.25～60 mg/L，相關系數R2為0.991 1～0.994。以信噪比(S/N)大于3和10分別作為檢出限和定量限的判斷標準，得出檢出限為0.06～0.36 mg/L，定限量為0.20～1.19 mg/L。以上結果表明本方法可有效檢測痕量生物胺。

表2 方法性能特征Table 2 The performance characteristics of the proposed method

為評估方法在醬腌菜中的實際適用性，使用HPLC方法分析3種不同質量濃度生物胺添加到醬腌菜中的回收率。結果如表3所示，回收率在71%～105%，相對標準偏差為0.01%～0.57%，相對標準偏差<5%。說明醬腌菜中的基質對HPLC方法測定生物胺的影響很小，該方法檢測醬腌菜中生物胺含量是可靠的。

表3 醬腌菜樣品中8種生物胺的回收率Table 3 Recovery rates of 8 biogenic amines in pickles

2.2 強發酵類醬腌菜生物胺含量

收集到的71個強發酵類型醬腌菜包括20個東北酸菜和51個現代工業泡菜半成品。其中東北酸菜屬于低鹽、低溫、長時間發酵，現代工業泡菜發酵成熟后大多采用高鹽長時間貯藏，兩者都屬于深度發酵泡菜，含大量乳酸，其總酸含量普遍達到為10 g/kg(數據未顯示)。強發酵類醬腌菜生物胺含量如表4所示，包裝的東北酸菜生物胺平均含量約為(613.4±163.1) mg/kg(n= 20)，含量在364.4～968.2 mg/kg，研究結果與LIU等[9]和KALAC等[13]相一致。51個現代工業泡菜半成品生物胺平均含量為(800.4±370.9) mg/kg(n= 51)，含量在106.4～1 708.5 mg/kg，其中有27%的樣品中生物胺含量超過1 000 mg/kg。有研究報道，當食品中的總生物胺含量超過1 000 mg/kg時對健康有風險[14-16]。現代工業泡菜中高含量生物胺的累積可能歸因于長時間發酵，其中RABIE等[17]研究發現德國酸菜貯藏45 d后的生物胺總量高達1 553 mg/kg，組胺和酪胺的含量都高于200 mg/kg。PEAS等[18]也研究得出貯藏時間對德國酸菜中生物胺含量有顯著的影響。其中氨基酸脫羧酶的微生物扮演著重要的作用，唐垚等[19]從四川泡菜中篩選出解鳥氨酸拉烏爾菌，含有賴氨酸脫羧酶cacd基因和組氨酸脫羧酶hdc基因，回接發酵48 h產尸胺達(766.67±2.17) mg/L。基于此，篩選及接種不產生物胺的乳酸菌來調控泡菜發酵，從源頭上減少生物胺的形成是一種有效途徑。LARANJO等[20]和RABIE等[17]提出采用乳酸菌發酵劑可以減少泡菜中生物胺的累積，RABIE等[17]將植物乳桿菌2142、干酪乳桿菌干酪亞種2763和彎曲乳桿菌2771接種于自然發酵泡菜中，總的生物胺含量仍大大低于對照組，所有泡菜中腐胺降低10倍。

表4 強發酵類醬腌菜總生物胺含量Table 4 Concentrations of total biogenic amines in intense fermentation pickles

強發酵類醬腌菜中8種生物胺分布如表5所示，腐胺、尸胺、組胺和酪胺是東北酸菜和現代工業泡菜半成品中的主要生物胺，其中尸胺含量最高。組胺和酪胺被認為是毒性最高的，特別是與不良健康影響有關[21]，其中腐胺和尸胺被稱為組胺的增強劑[22]。另外，腐胺和尸胺可以與亞硝酸鹽結合形成可致癌的N-亞硝胺[23-24]。然而有關總生物胺毒性的研究比較有限，大多數集中在組胺和酪胺，當組胺攝入量為8～40、40～100和高于100 mg時分別可能引起輕度、中度和重度中毒[25]。攝入100 g組胺含量高于400 mg/kg的食物會引起中毒，歐盟和美國食品藥品監督管理局分別將組胺含量限定為100和50 mg/kg[26]。組胺是我國唯一被正式限制的生物胺，在魚制品中限定為300 mg/kg，而醬腌菜中的生物胺含量沒有官方限制。若以國際上組胺的限量，至少有50%東北酸菜樣品和45%工業泡菜半成品是不合格。據報道，酪胺的最高允許含量為100～800 mg/kg，攝入過量是有毒的[14]。目前，尚未建立對食品中腐胺和尸胺的官方限量標準，RAUSCHER等[23]建議將泡菜腐胺和尸胺的最高容許濃度分別設定為140和430 mg/kg。若根據酪胺、腐胺和尸胺的建議含量，至少50%東北酸菜樣品和73%的現代工業泡菜半成品可能對健康有風險，但兩者都不直接食用，都屬于醬腌菜加工過程中的原料，后期經過清洗等，生物胺濃度會出現大幅降低。

表5 強發酵類醬腌菜生物胺分布Table 5 Distribution of biogenic amines contents in intense fermentation pickles

強發酵類醬腌菜中發現的主要生物胺是腐胺、尸胺、組胺和酪胺。生物胺積累主要歸因于醬腌菜的生產過程，在相同工藝中，蔬菜類型是影響生物胺產生的重要因素。工業泡蘿卜半成品顯示出最低的生物胺含量，平均含量為(383.6±180.0) mg/kg，和其他原料半成品間呈顯著性差異(P<0.05)，而工業泡豇豆半成品具有較高的生物胺含量，平均含量達到(1 113.0±434.1) mg/kg。盡管半成品醬腌菜顯示出較高的生物胺含量，但通常不直接用于消費，這些醬腌菜作為現代工業泡菜生產的原料。

2.3 強發酵類醬腌菜生物胺含量

根據發酵程度差異，弱發酵類醬腌菜包含傳統四川泡菜、辣白菜、芽菜、冬菜等，屬于地方特色產品，總酸含量介于0.3～0.4 g/kg，其生物胺含量如表6和表7所示。收集到不同蔬菜原料和不同包裝形式的傳統四川泡菜樣品87個，平均生物胺含量為(126.2±162.1) mg/kg，介于9.9～987.8 mg/kg。不同蔬菜原料制備的傳統四川泡菜生物胺含量差異明顯，其中由青芥菜制成的泡菜生物胺含量[(323.3±317.2) mg/kg，n= 10]比其他蔬菜原料泡菜明顯更高。與強發酵類醬腌菜生物胺結果相一致，腐胺、尸胺、組胺和酪胺是傳統四川泡菜中的主要生物胺，但腐胺濃度最高，達到(44.1±47.0) mg/kg。根據國際上對組胺的限量，傳統四川泡菜大部分屬于合格產品。根據酪胺、腐胺和尸胺的建議含量，2.3%的傳統四川泡菜可能存在健康風險。辣白菜生物胺含量[(147.0±123.5) mg/kg，n=12]與傳統四川泡菜類似，范圍介于65.8～486.2 mg/kg，主要生物胺為腐胺、尸胺和酪胺，但組胺含量較低，尸胺含量高達(80.6±47.0) mg/kg。其他樣品生物胺平均含量為(175.9±127.3) mg/kg，介于15.6～666.5 mg/kg，僅發現1個樣品生物胺含量超過500 mg/kg。綜合來看，腐胺、尸胺、組胺和酪胺是我國地方特色醬腌菜中最常見的生物胺，其中尸胺含量偏高，達到(74.4±57.5) mg/kg。

表6 弱發酵類醬腌菜總生物胺含量Table 6 Concentrations of total biogenic amines in weak fermentation pickles

表7 弱發酵類醬腌菜生物胺分布Table 7 Distribution of biogenic amines in weak fermentation pickles

以芽菜和冬菜為代表的高鹽、低水分等作用下，微生物作用弱，生物胺積累少；大部分餐館中的傳統四川泡菜屬于“洗澡泡菜”，又稱“過夜泡菜”，其發酵時間短，產酸量低等，泡菜中生物胺主要來自原料和泡菜液長期累積的生物胺。弱發酵類醬腌菜發酵程度低，生物胺的積累較少，腌制質量更好。有趣的是辣白菜中組胺含量較低，可能與其發酵環境不利于產組胺微生物的生長，使組胺的積累少。發酵程度越深，將產生更多的生物胺，這主要與產胺微生物有關。

在相同的工藝生產中，生物胺的產生也受蔬菜類型的影響。弱發酵類醬腌菜中的葉類蔬菜(青芥菜)和果類蔬菜(豇豆)比根類蔬菜(蘿卜)更容易產生生物胺。傳統泡豇豆生物胺含量[(222.1±219.0) mg/kg，n=11]比泡辣椒[(83.3±59.3) mg/kg，n=11]明顯更高，即使豇豆和辣椒都是水果蔬菜。該結果可能歸因于蔬菜表面的微生物差異和產胺微生物的數量。散裝泡甘藍中生物胺含量明顯高于包裝產品，這可能是家庭、餐館加工的衛生環境比工廠化加工環境差有關。由于工廠包裝產品經過滅菌處理，而散裝樣品在運輸和存儲過程中容易受到污染，導致生物胺累積。

2.4 不發酵類醬腌菜生物胺含量

不發酵醬腌菜包含現代工業泡菜成品和調味海帶，其生物胺含量如表8所示，所有產品生物胺含量都低于500 mg/kg，其中現代工業泡菜成品生物胺含量[(177.6±105.1) mg/kg，n=70]明顯低于半成品[(800.4±370.9) mg/kg，n=51]，介于21.2～493.9 mg/kg。相比半成品，可能是由于在加工過程中的脫鹽和脫水工序使生物胺濃度被稀釋。工業泡蘿卜產品顯示出最高的生物胺含量，達到(203.4±143.9) mg/kg，值得注意。調味海帶生物胺含量明顯低于蔬菜制品的醬腌菜，包裝和散裝調味海帶生物胺的含量相一致[(36.2±27.9) mg/kg，n= 19]，介于5.3～74.0 mg/kg。通常認為散裝樣品中生物胺平均含量較高，可能與發酵過程中違反了衛生指標和/或制造工藝不當有關。

表8 不發酵類醬腌菜總生物胺含量Table 8 Concentrations of total biogenic amines in no fermentation pickles

不發酵類醬腌菜生物胺含量分布如表9所示，腐胺、尸胺、組胺和酪胺也是現代工業泡菜產品中主要的生物胺，其中尸胺含量高達(79.4±79.3) mg/kg。根據國際上組胺限量標準，現代工業泡菜產品中有4.3%(70個樣品中的3個)超過100 mg/kg，存在健康有風險，僅有1個樣品的酪胺高于100 mg/kg。

表9 不發酵醬腌菜生物胺分布Table 9 Distribution of biogenic amines in no fermentation pickles

除蘿卜外，由其他現代工業泡菜半成品制成的產品在通過脫鹽和脫水過程顯著降低了生物胺含量，從而使現代工業泡菜滿足了食品安全要求。但是，由于原料和發酵程度的不同，現代工業泡菜樣品比調味海帶樣品顯示出更高的生物胺含量。19個調味海帶中未發現色胺，并且95%(總計18個)中含有酪胺，且含量最高，平均濃度達(13.2±9.0) mg/kg，但明顯低于大部分蔬菜制品醬腌菜。說明發酵過程對醬腌菜中生物胺的積累非常重要，不發酵類醬腌菜生物胺的含量取決于原料中生物胺的濃度，該結果和郭曉麗等[27]研究結果相一致。

3 結論

本文通過研究我國不同工藝299個醬腌菜樣品中生物胺含量分布，首次比較不同加工醬腌菜中生物胺含量。盡管腌制食品安全性評估的結果尚需進一步補充，但在這項研究中發現了影響生物胺產生的主要因素。首先，加工工藝是產生生物胺的最重要因素。其次，蔬菜類型和衛生狀況會影響醬腌菜中生物胺的積累。

大多數醬腌菜中的生物胺以腐胺、尸胺、組胺和酪胺為主，但辣白菜中組胺含量較低，調味海帶的生物胺含量明顯低于發酵類醬腌菜。從所有分析的樣品中，至少有50%的東北酸菜樣品、4.5%的傳統四川泡菜樣品和4.3%的現代工業泡菜樣品超出了歐盟和美國食品藥品監督管理局報告的組胺限量。因此，大多數商業化或家庭生產的泡菜都可以被認為是安全的。但是，需要一種更有效的質量控制系統來提高我國醬腌菜食品的安全性。