苯并[a]芘及其代謝產物與DNA加合物檢測方法的研究進展

王珠琳，袁莉，張萌

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

近幾年，關于苯并[a]芘及其代謝產物與DNA加合物的相關研究文獻數量變化如圖1所示，由圖1可知關于苯并[a]芘及其代謝產物與DNA加合物的研究一直處于備受關注的狀態。隨著科技水平的提高，苯并[a]芘及其代謝產物與DNA加合物的檢測技術有待進一步突破，從而加深對苯并[a]芘及其代謝產物與DNA加合物毒性作用的研究，為保障人體健康作出貢獻。

1 苯并[a]芘概述

苯并芘(benzopyrene)是由芘和苯稠合而成的一類多環芳香烴類化合物[1]，主要有1,2-苯并芘、3,4-苯并芘、4,5-苯并芘等[2]。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)又稱3,4-苯并芘，分子式為C20H12，相對分子質量為252.31，在常溫條件下，為晶狀固體，呈淺黃色，沸點為312 ℃，熔點為179 ℃[3]，其化學結構式如圖2所示。B[a]P是苯并芘中毒性(致癌性、致畸性和致突變性)最強且難降解的一種化合物[4]，同時也是多環芳烴的指標化合物。

2 B[a]P檢測時樣品前處理方法

為了提高檢測方法的靈敏度、精確度，減少非待測組分的干擾，通常要對食品或環境中的B[a]P進行前處理。可根據待測樣品的特性選擇最佳的前處理方法，有助于待測物的檢測。檢測B[a]P的前處理方法主要有固相萃取法、固相微萃取法、液液萃取法、濁點萃取法、凝膠滲透色譜法、分子印跡固相萃取等，如表1所示。

表1 苯并[a]芘檢測時樣品前處理方法Table 1 Methods of sample pretreatment for detection of B[a]P

3 B[a]P的檢測方法

由于B[a]P對人體健康危害較大，快速檢測出食品或環境中的B[a]P尤為重要。為了進一步提高檢測的靈敏度、精確度，時常將2種或多種方法進行聯用。目前檢測B[a]P的方法有高效液相色譜-熒光法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜-串聯質譜法、表面增強拉曼光譜檢測法等[14-26]；此外，還可通過免疫分析法來檢測B[a]P，如ELISA試劑盒法、電化學免疫傳感器、金標免疫層析技術[6]，如表2所示。

表2 B[a]P的檢測方法Table 2 Detection methods of B[a]P

4 B[a]P代謝產物的種類

B[a]P在機體中可通過酶促反應(細胞色素P450酶、環氧還原酶和環氧水解酶等)或非酶促反應被代謝為多種產物，一般分為二醇類、酚類、環氧類和醌類[24]。環氧化物主要有B[a]P 2,3-，4,5-，7,8-和9,10-環氧異構體，這些環氧化物可被環氧水解酶轉化為反式二氫二醇異構體[25]。此外，環氧化合物還可以通過非酶促反應轉化為酚類化合物如1-OH B[a]P、3-OH B[a]P、6-OH B[a]P、7-OH B[a]P、9-OH B[a]P等[26]，B[a]P的代謝產物結構式如圖3所示。

5 B[a]P代謝物與DNA加合物種類及其檢測方法

B[a]P不與DNA直接發生反應，當通過二醇-環氧途徑、鄰醌途徑和自由基陽離子途徑被代謝活化后才與DNA形成加合物。而DNA加合物是B[a]P危害機體的一類重要生物標志物，若其造成的DNA損傷不能被及時修復，則會導致基因突變誘發癌癥，因此DNA加合物可為癌癥風險評估提供重要的參考信息，對于發展相關疾病預防和治療手段具有重要意義[33]。目前，DNA加合物常用的方法有32P后標記法、免疫分析法、色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法等，但由于生物體中DNA加合物含量極低，對其分析和鑒定仍然存在較大困難，有待進一步發展[28]。

5.1 B[a]P-7,8-氫二醇-9,10-環氧化物dG加合物

在細胞色素P450(CYP450)酶、環氧水解酶以及其他酶的作用下，B[a]P被代謝為B[a]P-7, 8-二氫二醇-9, 10-環氧化物(B[a]P-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide，BPDE)，是B[a]P的最終致癌代謝物[29]。BPDE會與細胞DNA發生結合，在脫氧鳥苷的N2位形成BPDE-N2-dG 4種立體異構體加合物[30]如圖4所示，其形成過程如圖5所示，從而造成DNA損傷，但通常可以通過核苷酸切除修復和堿基切除修復2個通路進行修復，而當核苷酸切除修復和堿基切除修復2個通路中相關基因受到損傷時，細胞DNA修復能力喪失[31]， 則由BPDE引起的DNA損傷不能被修復，從而誘發癌癥以及其他疾病。此外，BPDE-DNA加合物與DNA甲基化呈正相關，原因可能是BPDE與DNA的結合會通過影響DNA甲基轉移酶的活性而促進DNA的甲基化，或者由于BPDE-DNA加合物的位點甲基化增加所致[32]，由BPDE-DNA加合物引起的DNA甲基化異常也會導致許多復雜的疾病。

BPDE-N2-dG加合物既是接觸(暴露)生物標志，又是一種效應標志物[33]，對其定性或定量分析是開展相關研究的一個重要基礎，可進一步揭示人類重大疾病的分子機制。目前，對于BPDE-N2-dG的檢測方法越來越多，其中常用的方法包括32P后標記法、免疫分析法、液相色譜串聯質譜法、毛細管電泳-激光誘導熒光法等，其檢測方法及其應用如表3所示[34-41]。

表3 BPDE-N2-dG的檢測方法及應用Table 3 Detection method and application of BPDE-N2-dG

5.2 B[a]P-7,8-二酮-DNA加合物

B[a]P-7,8-二酮(B[a]P-7,8-dione，BPQ)是由(±)-B[a]P-7,8-反式二醇經醛酮還原酶(aldehyde ketone reductase，AKR)催化形成的[42]。它既具有親電性，又具有氧化還原活性，親電性使得BPQ能與DNA通過加成反應生成BPQ-DNA加合物[43]。而這些BPQ-DNA加合物在體內不穩定，不易被檢測到，如NESNOW等[33]對A/J雄性小鼠進行BPQ和B[a]P-7,8-腹腔注射后，通過32P后標記分析小鼠肺和肝臟中的DNA，未檢測到BPQ-DNA加合物，但小鼠體重隨時間顯著下降，表明這2種藥物均可引起全身毒性。

多項研究通過體外實驗，對BPQ-DNA加合物進行了研究，為體內BPQ介導的遺傳毒性和致癌作用奠定基礎。HUANG等[44]通過液相色譜串聯質譜對經過BPQ處理后的人肺腺癌A549細胞，人支氣管肺泡H358細胞，永生化人支氣管上皮HBEC-KT細胞中BPQ與DNA加合物進行檢測，在A549細胞和HBEC-KT細胞中發現了BPQ-DNA加合物。BALU等[45]在生理PH條件下合成4個BPQ與dG、2個BPQ與dA加合物，并通過高效液相色譜/電噴霧-質譜進行了鑒定和表征。BALU等[46]還制備了dGMP(3′)、dAMP(3′)和dCMP(3′)與BPQ加合物，并通過UV、LC/MS以及一維和二維核磁共振技術對制備的加成物進行了表征。

5.3 自由基陽離子-DNA加合物

B[a]P經CYP450酶催化后會生成自由基陽離子[47]，該陽離子與DNA相互作用，主要是在B[a]P的C6位置與鳥嘌呤的N7和C8位置以及腺嘌呤的N7位置形成脫嘌呤的加合物[48]。CHEN等[49]在雌性瑞士小鼠局部皮膚上用B[a]P處理4 h后處死小鼠，對處理過的皮膚進行前處理，然后通過HPLC和熒光線窄光譜法分析出5種DNA加合物分別是：B[a]P-6-C8-Gua、B[a]P-6-N7-Ade，B[a]P-C6-N7-Gua和少量BPDE-C10-N7-Ade和BPDE-C10-N7-Gua，其中自由基陽離子與DNA加合物占總DNA加合物的66%。由于自由基陽離子的壽命短，SEN等[50]通過檢測自由陽離子下游產物B[a]P-1,6-二酮和B[a]P-3,6-二酮來確定經B[a]P處理后酵母菌株中自由陽離子水平，研究發現自由陽離子水平隨B[a]P劑量的增加而增加，而自由基陽離子會與DNA形成加合物，但不穩定迅速被分解，會造成DNA突變，通過對P53基因進行測序，發現BPQ的誘變性比自由基陽離子強，且大多數突變都在鳥嘌呤殘基處，表明加合物大多在鳥嘌呤上形成。

6 總結與展望

本文詳細綜述了檢測B[a]P時樣品前處理方法及其檢測方法、代謝產物的種類以及B[a]P經過二醇-環氧途徑、鄰醌途徑和自由基陽離子途徑被代謝活化后的產物與DNA加合物的形成過程和檢測方法，為分析檢測B[a]P和預防其毒性提供參考。DNA加合物作為B[a]P危害機體的一類重要生物標志物，對其檢測具有重要意義，但其檢測方法還存在一些問題，應對DNA加合物的檢測方法進行進一步探索，提高檢測方法的精確度、靈敏度，為更好地探究各種有害物質的毒性機理提供參考依據，同時為發展相關疾病預防和治療手段做出貢獻。