基于網絡藥理學探討大復方祛邪膠囊治療結直腸癌的作用機制

宋卓 陳悅 翟嘉威 谷珊珊 唐末 龔璐天 楊宇飛 許云

摘要 目的：大復方祛邪膠囊是基于明代醫家李中梓治療積聚的名方——陰陽攻積丸研制而成，文章通過網絡藥理學方法挖掘其對結直腸癌的作用機制，為揭示經典名方陰陽攻積丸的臨床價值和現代機制提供借鑒。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、中醫藥百科全書（ETCM）等數據庫篩選祛邪膠囊的活性成分及靶點，通過Swiss Target Prediction靶標垂釣，取藥物靶點的并集。通過TTD、OMIM、Drugbank和GeneCards數據庫篩選結直腸癌的靶點，取并集。取藥物靶點與疾病靶點的交集，并依據化合物的Degree值篩選，建立“中藥-成分-靶點”數據庫，依據核心靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，進行基因本體（GO）功能和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，與前期研究結果進行對比。結果：構建祛邪膠囊治療結直腸癌的活性成分127個，靶向254個核心基因，核心基因的PPI網絡包含248個節點，共有5個核心網絡。富集分析顯示祛邪膠囊可能主要通過調控RNA聚合酶的啟動、DNA轉錄、翻譯、蛋白的激活和增殖、凋亡、耐藥、炎癥反應等過程介導HIF-1α、PI3K/Akt、TNF、FoxO、Toll樣受體等多個信號通路，其中凋亡、免疫方面的調節及FoxO信號通路得到本團隊前期研究的驗證。結論：祛邪膠囊治療結直腸癌的作用機制與介導凋亡、免疫及FoxO信號通路方面有關，此外還可能調控HIF-1α、PI3K/Akt、TNF、Toll樣受體等多個信號通路，體現了祛邪膠囊治療結直腸癌成分多、調控通路和靶點復雜的特點，同時展現了古人“反激逆從”和“溫陽通下”論治腫瘤的理論魅力和臨床價值，為后續的深入研究提供指導。

關鍵詞 結直腸癌;網絡藥理學;大復方;祛邪膠囊;陰陽攻積丸;經典名方;分子機制;中草藥

Exploring the Mechanism of a Great Prescription （Quxie Capsule） in Treatment of Colorectal Cancer Based on Network Pharmacology

SONG Zhuo1， CHEN Yue1，2， ZHAI Jiawei1，2， GU Shanshan1， TANG Mo1， GONG Lutian1， YANG Yufei1， XU Yun1

（1 Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China; 2 Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：Dafufang Quxie Capsules are developed based on the famous prescription Yinyang Gongji Pills used by the physician LI Zhongzi in the Ming Dynasty to treat accumulation. The uses network pharmacology to explore its mechanism of action on colorectal cancer， in order to reveal the classic prescription Yin Yang Gongji Pills Provide reference for clinical value and modern mechanism. Methods：TCMSP， ETCM and other databases were searched to establish the database of active ingredients and targets of Quxie Capsules. Fishing through the Swiss Target Prediction target， we took the union of the drug targets. Through TTD， OMIM， Drugbank and GeneCards databases， we screened the targets of colorectal cancer and took the union. We took the intersection of drug target and disease target， and screened according to the degree value of the compound， established a “Chinese medicine-component-target” database， constructed a PPI network based on the core target， performed GO function and KEGG enrichment analysis， and compared the results with preliminary research. Results：The final data about Quxie Capsule for the treatment of colorectal cancer had 127 active ingredients targeting 254 core genes. The PPI network contains 248 core genes， and there were 5 subnet networks in total. Enrichment analysis results showed that Quxie Capsules may mediate HIF1α， PI3K/AKT， TNF， FoxO， Toll-like receptors through processes such as the initiation of RNA polymerase， DNA transcription， translation， protein activation and proliferation， apoptosis， drug resistance， and inflammation. And many other signaling pathways， among which the regulation of apoptosis， immunity and FoxO signaling pathway have been verified by our team′s previous research. Conclusion：Mechanism of Quxie Capsules on the treatment of colorectal cancer is related to mediating apoptosis， immunity and FoxO signaling pathway. In addition， it may also regulate multiple signaling pathways such as HIF1α， PI3K/AKT， TNF， and Toll-like receptors. This revealed that Quxie Capsules have many components in the treatment of colorectal cancer， and its regulatory pathways and targets are complex. At the same time， it demonstrates the theoretical charm and clinical value of the ancients′ “anti-excitement and rebellion” and “warming yang and ventilating the lower part” theory of treating tumors， providing guidance for follow-up in-depth research.

Keywords Colorectal cancer; Network pharmacology; Great prescription; Quxie Capsules; Yinyang Gongji Pills; Classic prescription; Molecular mechanism; Chinese medicinal

中圖分類號：R285;R273;R242文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.002

結直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）是常見的胃腸道惡性腫瘤，占全球所有癌癥病例的10%以上，對社會經濟造成沉重負擔[1]。近20年來，我國結直腸癌的發病率顯著增長，預計2020年患病人數將達到30萬[2]。中醫藥作為獨具我國特色的傳統醫學方法，在多種辨治思想的指導下成為結直腸癌綜合治療體系中必不可少的組成部分[3]。

中國中醫科學院西苑醫院楊宇飛教授團隊20余年來致力于結直腸癌的中西醫結合研究，在“陰瘤理論”指導下，挖掘古代經典名方“陰陽攻積丸”研制出院內制劑祛邪膠囊。祛邪膠囊主要由巴豆、吳茱萸、豬牙皂、雞內金、生麥芽等21味中藥組成，融溫散、理氣、化痰、散結、通下為一爐，扶陽散陰或遏陽消陰，祛除體內的致癌因素如痰毒、瘀毒、濕毒等病理產物，從中醫的病根上治療結直腸癌[4]。我們團隊既往的隊列研究和隨機對照研究表明祛邪膠囊在減少Ⅱ/Ⅲ期結直腸癌術后復發，延長晚期腸癌生存期，提高腸癌患者生命質量上均有較好的療效[5-7]?；A研究方面，祛邪膠囊在調節小鼠免疫和腸道微生態平衡方面也都有一定的效果[8-9]。然而，鑒于中醫理論的特殊性，祛邪膠囊配伍復雜、藥味多、活性成分雜而不明，作用靶點網絡化，且部分藥物有一定的毒性，使得其組方配伍的篩選、優化和藥效機制研究均面臨較大的困難。

中藥網絡藥理學（Network Pharmacology）基于“藥物-靶點-基因-疾病”之間的復雜關系，從分子水平上闡明藥物與疾病網絡之間的協同效應和潛在機制[10]。其系統性、整體性的特點與復方的整體觀不謀而合，為大復方的深入研究提供了一個新的思路[11]。本研究采用網絡藥理學方法，探索祛邪膠囊治療結直腸癌的分子機制，并結合前期研究結果進行佐證，從分子水平探索大復方祛邪膠囊的體內生物學特征，為后續的組方優化和機制研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 祛邪膠囊治療結直腸癌網絡藥理學分析的流程圖。見圖1。

1.2 祛邪膠囊活性成分及對應靶點的收集

借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[12]和中醫藥百科全書（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）[13]分別檢索祛邪膠囊巴豆霜、豬牙皂、吳茱萸、干姜、肉桂、川烏、黃連、半夏、橘紅、茯苓、檳榔等19味組方中藥的活性成分。TCMSP數據庫依據藥物吸收、分布、代謝、排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME）特性的口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）作為篩選指標，篩選閾值為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出符合條件的活性成分及對應靶點;對于不符合篩選條件但既往被驗證靶向結直腸癌的化合物及其靶點也納入本研究。ETCM篩選可靠性分值大于0.8的化合物及對應靶點。由于雞內金的活性成分在TCMSP、ETCM均未納入，因而通過BATMAN-TCM數據庫[14]和化學專業數據庫[15]進行篩選;而琥珀在上述4種數據庫均無靶點的記錄。同時，通過文獻搜索21味中藥中已被驗證治療結直腸癌的活性成分及靶點完善數據。應用Uniprot數據庫[16]中的蛋白轉化功能，將TCMSP獲得的蛋白靶點依據物質為“Human”、證據來源為“Reviewed”轉化為對應的基因名稱。利用PubChem數據庫[17]，將所有活性化合物轉化為標準的Canonical SMILES格式，統一化合物的CAS號，應用Swiss Target Prediction在線數據庫[18]預測篩選的所有活性化合物的可能靶點，擴充其靶點信息。

1.3 結直腸癌疾病靶點收集

以“colorectal cancer”作為檢索詞檢索GeneCards[19]、OMIM數據庫[20]、TTD數據庫[21]和Drugbank[22]4大數據庫，篩選CRC的靶點基因。其中，GeneCards查詢到與CRC相關的靶點基因較多，依據Relevance篩選出與CRC相關性較大的靶點基因，并將4大數據庫篩選的結果合并得到CRC疾病的靶點基因。

1.4 “中藥-成分-靶點”網絡圖的構建

本研究采用Cytoscape 3.7.1[23]構建祛邪膠囊治療CRC的“中藥-成分-靶點”的網絡圖展現其藥理關系。由于祛邪膠囊的組方大、成分多，直接構建的網絡藥理圖會極其復雜，本研究分別依據其靶點和活性成分縮選，構建準確率更高的數據網絡。首先，本研究將祛邪膠囊活性成分的靶點與CRC疾病的靶點取交集，通過交集靶點篩選其對應的活性成分和中藥。其次，本研究將縮窄后得到的數據通過Cytoscape 3.7.1分析，依據Degree≥10篩選活性成分，并以此構建“中藥-成分-靶點”數據庫，利用Cytoscape 3.7.1可視化處理。

1.5 靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖的構建

將篩選得到的核心靶點利用String數據庫[24]，依據Homo sapiens，minimum required interaction score>0.7篩選，刪除單一的靶點以保證網絡的可讀性，構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網絡圖，并導入Cytoscape 3.7.1可視化處理。使用Cytoscape的MCODE功能對PPI網絡進行模塊分析，設置K-core值>4。

1.6 祛邪膠囊治療CRC預測靶點的富集分析

利用DAVID數據庫[25]對核心靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并限制物種為人，得到的分析結果以P<0.01進行篩選，將所得結果與前期研究對比分析，最后通過在線網絡作圖工具進行可視化處理。統計上述祛邪膠囊治療CRC的核心通路和相關靶點的信息，構建祛邪膠囊的核心通路-靶點關聯網絡并可視化處理。

2 結果

2.1 祛邪膠囊治療CRC活性成分、靶點的篩選

TCMSP和ETCM數據庫檢索到祛邪膠囊19味中藥共有活性化合物831個，靶點1 318個，“中藥-化合物-靶點”19 077組;其中BATMAN-TCM數據庫和化學專業數據庫檢索到雞內金含有的活性化合物3個，對應靶點19個，“中藥-化合物-靶點”19組;祛邪膠囊的干預靶點匯總后共有1 329個。

GeneCards數據庫獲得CRC的靶點8 933個，依據Relevance的中位數篩選3次得到靶點基因1 121個，TTD數據庫靶點基因85個，OMIM數據庫靶點基因496個，Drugbank數據庫靶點基因24個，綜合4大數據庫共獲得CRC疾病的靶點基因1 561個。

將祛邪膠囊活性成分的靶點與CRC疾病的靶點取交集，得到的交集靶點基因共282個，這些靶基因來源于祛邪膠囊中的20味中藥的642個活性化合物，得到“中藥-化合物-靶點”5 385組。考慮祛邪膠囊的組方較大，部分化合物僅靶向少數的靶點，本研究將縮窄得到的數據導入Cytoscape 3.7.1分析，并依據活性成分的Degree≥10，篩選出祛邪膠囊治療CRC可能性較大的活性成分127個。見表1，靶向254個基因，“中藥-化合物-靶點”3 418組，來源于19味中藥。雞內金因其所含活性成分及靶點基因與結直腸癌的相關性不高而被上述過程篩掉。

2.2 祛邪膠囊治療CRC“中藥-成分-靶點”的網絡分析

將2.1篩選得到的數據導入Cytoscape 3.7.1構建祛邪膠囊治療結直腸癌的靶點網絡，網絡模型中共有399個節點，3 699條連接。見圖2。該網絡模型拓撲結構分析的Degree平均值約18.54，中位數12。網絡模型中的靶點均有較高的Degree值，提示這些靶點受祛邪膠囊多味藥的多種成分的綜合調控。本研究進一步對各靶點受祛邪膠囊調控的重要程度進行分析，靶點的Degree值越高表示其越可能是祛邪膠囊作用的主要靶點。靶點網絡的254個靶點有57個的Degree值≥20，有19個靶點的值≥36（PTGS2，PTGS1，AR，ESR1，ADH1C，ESR2，PPARG，PGR，PIK3CG，NOS3，PRSS1，AHR，TNF，RHO，PPARD，BCL2，INS，CYP1B1和PRKACA）。

2.3 祛邪膠囊治療CRC靶點的PPI網絡分析

將篩選得到的254個核心靶點基因采用String數據庫構建蛋白靶點PPI網絡，并經Cytoscape可視化處理。該PPI網絡包含248個節點，2 853條邊，平均Degree為23。進一步對靶點網絡開展MCODE子簇分析，得到5個子網絡。見圖3。圖中圓形表示靶點，靶點越大代表的Degree值越大，在PPI中越關鍵，線條表示靶點間的相互作用，作用越強，線條越粗。采用DAVID數據庫對子簇進一步富集分析，發現這些子簇聚集的與CRC密切相關的前10條信號通路為病毒致癌作用、蛋白聚糖、細胞周期、p53信號通路、T細胞受體信號通路、HIF-1α信號通路、PI3K/Akt信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、Toll樣受體信號通路。

2.4 祛邪膠囊治療CRC關鍵靶點的生物功能富集分析

利用DAVID數據庫對祛邪膠囊治療CRC的254個核心靶點進行GO和KEGG富集分析，以P<0.01為界定值篩選。根據GO注釋結果篩選分別在分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組成（Cell Composition，CC）和生物過程（Biological Process，BP）富集中前10的條目。見圖4A。這些基因的生物過程主要涉及調控RNA聚合酶的啟動、DNA轉錄、翻譯、蛋白的激活和增殖、凋亡、耐藥、炎癥反應等方面。KEGG富集分析得到78個條目，前50個條目中與腫瘤相關的富集通路有29條，排除一些與特定腫瘤類型相關而非具體信號通路的條目，最終得到預測通路19條，并以此繪制富集通路的氣泡圖。見圖4B。富集結果顯示祛邪膠囊治療CRC核心基因主要富集的通路為HIF-1信號通路、蛋白聚糖、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、凋亡、p53信號通路、T細胞受體信號通路、FoxO信號通路、VEGF信號通路、核因子κB、MAPK、Toll樣受體信號通路等。

本團隊既往的基礎研究表明，祛邪膠囊能明顯抑制荷瘤小鼠結腸腫瘤細胞的生長（P<0.05），其機制與增加Bim、FasL和cleaved caspase-3蛋白的表達介導腫瘤細胞的凋亡有關;此外，祛邪膠囊能通過降低FoxO家族蛋白的表達來增加Th1細胞的數量和減少Treg細胞重塑腫瘤免疫抑制的微環境，這些結果對本研究進行了一定程度的驗證[8]。

進一步將上述祛邪膠囊治療CRC的核心通路和相關靶點整理，構建了祛邪膠囊的核心通路-靶點關聯網絡，圖中信號通路節點的大小和顏色深淺與相關的靶點數量成比例，顏色越深表明參與此通路調控的靶點越多。分析結果顯示祛邪膠囊治療CRC相關靶點參與的核心通路為PI3K-Akt信號通路、腫瘤相關的蛋白聚糖、microRNAs、Ras信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路等，調控的核心靶點基因為NFKB1、AKT1、PIK3CA、PIK3CG、MAPK1、MAPK3、RELA、HRAS、IKBKB、TP53、RAF1。見圖5。

3 討論

大復方祛邪膠囊由古人治療積聚的經典名方陰陽攻積丸研制而成，在溫通、瀉下、行氣、化痰、逐瘀的基礎上加了少量扶正和胃消食的中藥，共21味。陰陽攻積丸體現了古人針對復雜病證采用藥性相反、升降相逆中藥相激搭配的治療藝術，也體現了古人從“陽不化氣、陰成型”對腫瘤病機的認識[26-27]。增加扶正和胃消食中藥后的大復方祛邪膠囊，尤為符合結直腸癌虛、痰、瘀、寒的病機特點，集多種治法于一爐，體現了配伍嚴謹有序、精當貼切、機制明晰周全的中醫藥學魅力。這種大復方符合今人對腫瘤中醫病機認識復雜性的特點，遵循古人“大病需用大藥”的學術思想，在惡性腫瘤防治的臨床實踐中體現出較好的實際意義[28]。然而這種大復方組方復雜、成分眾多，應用現代科學技術對其藥效物質基礎和作用機制的研究面臨一定的困難。亦有專家指出，多成分多靶點是對中藥作用機制的表面認識，中藥作用機制實際上是藥物有效成分組成復雜物質體系與病理條件下作用靶點組成復雜生物體系的相互作用，這意味著從單成分、單靶點或單信號通路去揭示大復方作用機制存在一定的問題[29]。網絡藥理學基于生物數據庫及基礎和臨床實驗研究結果，借助數學模型和復雜網絡研究方法，將藥物的作用靶點與疾病相關的靶點對接，從而建立“藥物-靶點-基因-疾病”相互作用的網絡[30]。網絡藥理學反映了大數據時代復方中藥系統性研究的新趨勢，為大復方的深入研究帶來了新的思路和方法。

本研究利用網絡藥理學的方法初步探討了大復方祛邪膠囊治療結直腸癌的分子機制。通過活性化合物和靶點縮選后仍獲得祛邪膠囊治療CRC的活性成分127個，靶向254個基因，來源于19味中藥，表明祛邪膠囊作用于結直腸癌的機制極其復雜。富集分析顯示祛邪膠囊治療結直腸癌的機制除了與本團隊已經驗證的免疫、凋亡生物過程和FoxO信號通路相關外，還可能與調控HIF-1、PI3K/Akt、TNF、p53、VEGF、NF-κB、MAPK、Ras、Rap1、microRNA等信號通路相關。T細胞受體、FoxO、Toll樣受體和TNF信號通路均通過調控機體的免疫炎癥信號通路介導結直腸癌的發生和發展[31-34]，部分通路介導的免疫炎癥反應已得到我們前期基礎研究的驗證。p53是重要的抑癌基因，參與腫瘤的分化和轉移[35];Ras、Rap1是小G蛋白類的超家族成員，與MAPK在腫瘤細胞的增殖、分化等多種生物過程中都發揮重要的調控作用[36-38]，我們前期的研究也證實祛邪膠囊對結直腸癌細胞增殖、自噬、凋亡均有一定調控作用，其機制是否與這些分子通路相關尚需進一步驗證。HIF-1是哺乳動物體內普遍存在的缺氧應答調控因子，參與腫瘤細胞耐受微環境和血管生成等多個生物過程的調控[39];VEGF直接參與促進結直腸癌的血管新生過程[40];PI3K-Akt作為其下游的信號通路，參與腫瘤細胞包括增殖、分化、凋亡、侵襲轉移、新生血管生成在內的多個惡性生物行為[41-42]。microRNA[43]是一類進化高度保守的內源性非編碼RNA，可通過誘導抑癌基因失活、調控DNA甲基化、介導核酸多態性的遺傳修飾、調控傳統信號通路等機制影響CRC的發生發展，這些機制為本團隊后續的機制研究提供了新的思路。本研究預測的祛邪膠囊治療CRC的分子機制得到了我們前期研究的部分驗證，二者具有較好的一致性，同時體現其受眾多通路的綜合調控，作用機制極其復雜。

本研究的目的是借助網絡藥理學預測大復方祛邪膠囊治療CRC的分子機制，結合前期研究結果為后續研究提供指導，這就要求本研究納入更全面的數據。為此，本研究篩選了比較常用的2個中藥數據庫TCMSP和ETCM的活性化合物和靶點，依據化合物的ADME進行篩選，對不符條件但有被證實與結直腸癌相關的化合物也納入研究。同時采用文獻查找的方法進行補充，最終所有數據取并集。由于數據量較大，我們從化合物和靶點2個角度篩選最可能的化合物和靶點進行研究和展示。由于本研究無法考量組方劑量的配比，且忽略了化合物作用強弱的不同，存在無法按實際效用校正的不足，這些都是網絡藥理學研究無法回避的問題。此外，由于中藥數據庫積累的不足，準確性、不可控性以及研究方向的偏向性可能會使研究漏掉有用的活性化合物或靶點，制約了研究結果的可靠性，是本研究的不足。

4 結論

綜上所述，通過網絡藥理學技術預測祛邪膠囊通過眾多的活性化合物和復雜的信號通路調控CRC的增殖、凋亡及腫瘤微環境乏氧、血管生成、免疫炎癥機制的調控等多個生物學過程，部分通路和生物過程得到我們前期研究的驗證，為更深入探索祛邪膠囊治療CRC的分子機制奠定了基礎，展現了古人“反激逆從”和“溫陽通下”論治腫瘤的理論魅力和臨床價值，也為從系統生物學的角度研究大復方提供了借鑒。

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（2021-03-10收稿 責任編輯：徐穎）