2種昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾體表侵染模式的掃描電鏡觀察

雷妍圓 官昭瑛 Shoaib Freed Syed Muhammad Zaka Abid Hussin 章玉蘋

摘要：【目的】在前期篩選獲得對草地貪夜蛾高效致病真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株GZSL-1和玫煙色蟲草（Cordyceps fumosorosea）菌株IFCF01的基礎上，進一步明確2株菌株在草地貪夜蛾體表的侵染模式，為闡明菌株致病機理，提高昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的防效提供理論依據。【方法】利用掃描電鏡觀察草地貪夜蛾2齡幼蟲分別接種菌株GZSL-1和IFCF01（孢子懸浮液濃度為1.0×107孢子/mL）后分生孢子在幼蟲體表附著、萌發、穿透和增殖的過程。【結果】菌株GZSL-1和IFCF01萌發后均可形成附著胞，草地貪夜蛾幼蟲體表結構對2株菌株分生孢子萌發、附著和穿透芽管長度有不同程度的影響。2株菌株在各結構區均有較高的萌發率（>90.00%）和附著胞率（>80.00%），在平緩結構區比瘤狀突起結構區觀察到更短的穿透芽管。在各結構區，菌株GZSL-1形成的穿透芽管長度均短于菌株IFCF01相應的芽管長度，在平緩結構區，菌株GZSL-1的穿透芽管長度顯著短于菌株IFCF01（P<0.05）。菌株GZSL-1和IFCF01分生孢子接種后分別在16和8 h內萌發，在24和32 h內普遍出現穿透結構穿透草地貪夜蛾幼蟲體壁。2株菌株的初級和次級分生孢子分別在接種后72和96 h內出現。【結論】掃描電鏡觀察證實球孢白僵菌菌株GZSL-1和玫煙色蟲草菌株IFCF01對草地貪夜蛾具有高致病性，揭示了病原真菌分生孢子在草地貪夜蛾蟲體上的侵染過程，結果為后續2株菌株的改良及田間應用打下理論基礎。

關鍵詞： 球孢白僵菌;玫煙色蟲草;草地貪夜蛾;體表侵染;掃描電鏡

中圖分類號： S433.4;Q965.9? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0578-11

Mode of infection on the cuticle of Spodoptera frugiperda （Lepidoptera： Noctuidae） by two entomopathogenic fungi species revealed by scanning electron microscopy

LEI Yan-yuan1， GUAN Zhao-ying2， Shoaib Freed3， Syed Muhammad Zaka3，

Abid Hussin4， ZHANG Yu-ping1*

（1 Institute of Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou? 510640， China; 2 Shenzhen Institute of Technology， Shenzhen， Guangdong? 518116， China; 3Faculty of Agricultural Sciences and Technology， Bahauddin Zakariya University， Multan? 60800， Pakistan; 4College of Agricultural and Food Sciences， King Faisal University， Hofuf? 31982， Saudi Arabia）

Abstract：【Objective】In this study，based on the previous screening of the high pathogenic Beauveria bassiana strain GZSL-1 and Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 of Spodoptera frugiperda， the purpose of this study was to better understand the mode of action of these entomopathogenic fungi on the cuticle of S. frugiperda， and provide a theoretical basis for elucidating the pathogenicity mechanism of these two strains in order to achieve a constant and high control efficacy. 【Method】The attachment， germination， penetration and conidial reproduction of B. bassiana and C. fumosorosea to 2nd instar larvae of S. frugiperda infected with strains GZSL-1 and IFCF01（1.0×107 conidia/mL） were observed using scanning electron microscope（SEM）. 【Result】Germinated conidia of both strains formed appressoria， and surface topography of S. frugiperda larvae affected germination of conidia， attachment and the length of penetrating germ tube. The two strains showed similarities in terms of high germination rate（>90.00%） and appressoria rate（>80.00%）. There were shor-ter germ tubes grew before penetrating on gentle surface topography than on strumae surface topography. Strain IFCF01 exhibited longer penetrating germ tubes compared to GZSL-1 on all surface topographies. Besides， strain GZSL-1 exhibited significantly shorter penetrating germ tubes compared to strain IFCF01 on gentle surface topography（P<0.05）. Strains GZSL-1 and IFCF01 began to germinate within 16 and 8 h， and penetrations were commonly observed within 24 and 32 h. After 72 and 96 h post inoculation， primary and secondary conidiophore emerged and the mycelial covered the entire cuticular surface. 【Conclusion】SEM observation reveals the infection process of the highly pathogenic B. bassiana strain GZSL-1 and C. fumosorosea strain IFCF01 against S. frugiperda， the results of this study will further provide the theoretical basis and reference for strain improvement and field application.

Key words： Beauveria bassiana; Cordyceps fumosorosea; Spodoptera frugiperda; cuticle infection; scanning electron microscopy

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD0300104）; Science and Technology Planning Project of Guangdong（2020A1414010040）; International Science and Technology Organization Cooperation Project of “One Belt And One Road” of Guangzhou Association for Science & Technology（G20210101005）; Scientific Research Foundation of Shenzhen Institute of Technology（2111016）

0 引言

【研究意義】生物防治是害蟲綜合治理（IPM）的基本策略，在各種常用的生物防治技術中，基于昆蟲病原真菌的微生物防治有助于減輕化學農藥對人、畜和天敵昆蟲的毒害，促進生態平衡的良性循環，有利于綠色農產品的生產及以出口創匯為目標的農業產業化（何恒果等，2004;楊普云等，2018;張元臣等，2019;張志春等，2020）。病原真菌防治害蟲的過程，是一種生命替代另一種生命的過程。不像其他病原微生物（如細菌、病毒）需要被寄主攝取，真菌通過主動侵染控制蟲體而不依賴寄主的生活習性。真菌接觸至寄主昆蟲體表后，需要在一定的溫、濕度下經一定時間侵入，因此，昆蟲病原真菌侵染成功與否，與分生孢子在寄主體表的侵染過程密切相關（王音等，2005）。分生孢子對寄主表皮的非特異性附著是侵染過程的起始事件（Rangel et al.，2008;Chouvenc et al.，2009），隨后孢子萌發產生芽管或附著胞，生長為菌絲（Amóra et al.，2010），依靠這些侵染構造穿透寄主體壁進入體腔，克服寄主細胞和體液免疫防御，吸取寄主體內的養分而生長、增殖，在適宜的環境條件下，菌體從寄主體內穿出產生新的分生孢子并引起水平傳播（Khun et al.，2021）。昆蟲表皮是抵御病原真菌侵染的第一道屏障（Butt et al.，1995），由于不同昆蟲間表皮的物理結構和化學組成存在差異，導致一種病原真菌對不同種類昆蟲或同種昆蟲不同蟲態、齡期的防效不同，表現為菌株對不同靶標昆蟲的致病力差異和寄主專化現象（蒲順昌等，2013）。草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是熱帶和亞熱帶許多國家的重大遷飛性害蟲，其具有寄主范圍廣泛、取食能力強和抗藥性嚴重等特點，防控難度大（Casmuze et al.，2010;Early et al.，2018;Montezano et al.，2018;姜玉英等，2019;張磊等，2019）。自2019年我國首次發現草地貪夜蛾入侵，各省（區、市）、地級市的科研院所及有關部門加緊了對其應急預案及防控工作長效機制的構建，利用昆蟲病原真菌對該蟲進行微生物防治具有良好應用前景，是當前防控中的一個研究熱點。【前人研究進展】球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和玫煙色蟲草（Cordyceps fumosorosea）是研究和應用較為廣泛的昆蟲病原真菌，全球先后有171個真菌殺蟲劑產品問世，其中以球孢白僵菌和玫煙色蟲草為有效成分的制劑分別占33.9%和5.8%（de Faria and Wraight，2007;Hussain et al.，2014），在多種農林害蟲微生物防治中發揮了重要作用（蒲蟄龍和李增智，1996;Zimmermann，2008;Arthurs and Dara，2019）。關于球孢白僵菌和玫煙色蟲草與草地貪夜蛾的互作，國外已有大量且系統的研究報道（Bouamama et al.，2010;Akutse et al.，2020;Corrêa et al.，2020;González et al.，2020;Russo et al.，2020），國內相關研究才剛起步，特別是本地病原真菌與草地貪夜蛾互作體系中菌體侵染模式與寄主致病性的相關性尚無報道。在昆蟲病原真菌常見侵染結構中，金龜子綠僵菌（Metarhizium ani-sopliae）分生孢子通過形成附著胞結構對西花薊馬（Frankiniella occidentalis）表皮進行穿透，類似的還有淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinu）對爪哇根結線蟲（Meloidogyne javanica）（Holland et al.，2002）、兩型蠟蚧菌（Lecanicillium dimorphum）對棕櫚紅蚧（Phoenicococcus marlatti）（Asensio et al.，2005）和蠟蚧輪枝菌（L. lecanii）對擬褐圓蚧（Coccus hesperidum）（Liu et al.，2011）等。其他的諸如舞毒蛾噬蟲霉（Entomophaga maimaiga）和球孢白僵菌，直接以菌絲或芽管通過表皮上的氣孔進行穿透，而不需要形成附著胞（Hajek and Eastburn，2003;Asensio et al.，2005;Mauchline et al.，2011）。不同種類病原真菌或同種病原真菌不同菌株在侵染速度上也存在差異。金龜子綠僵菌侵染小菜蛾（Plutella xylostella）約在接種后22 h以穿透釘侵入表皮（王音等，2005），侵染微小扇頭蜱（Rhipicephalus microplus）在接種后48 h觀察到以芽管從排泄孔直接穿透（Bernardo et al.，2018）;玫煙色蟲草侵染菜青蟲（Pieris rapae）（張奐等，2007）和小菜蛾（Lei et al.，2021）均在接種后24 h以芽管穿透體壁進入寄主血腔;球孢白僵菌接種玉米螟（Ostrinia nubilalis）后24 h可觀察到大量孢子萌發并以芽管或菌絲穿透體壁（劉忱和郭志紅，2019），而接種光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）則需48 h才出現孢子萌發和穿透現象（鄧彩萍等，2012）。【本研究切入點】本課題組通過前期對草地貪夜蛾昆蟲病原真菌種類及防治潛能的評估（雷妍圓等，2020a，2020b），鑒定出對草地貪夜蛾具有高致病性的病原真菌球孢白僵菌菌株GZSL-1和玫煙色蟲草菌株IFCF01，其在1.0×107孢子/mL的孢子濃度下對草地貪夜蛾2齡幼蟲的致死中時（LT50）分別為2.77和2.22 d，致死中濃度（LC50）分別為1.17×105和3.42×103孢子/mL，表現出極大的生防潛力，但關于這2種病原真菌在草地貪夜蛾體表侵染模式尚未開展相關研究，不同菌株間孢子萌發行為、侵入方式的差異仍不清楚。【擬解決的關鍵問題】以球孢白僵菌菌株GZSL-1和玫煙色蟲草菌株IFCF01為材料，利用掃描電鏡對球孢白僵菌和玫煙色蟲草侵染草地貪夜蛾幼蟲過程中侵染結構的形成和表皮穿透過程進行超微結構研究，以明確高效菌株對草地貪夜蛾的侵染模式，探討寄主與病原真菌間的互作關系，為闡明昆蟲病原真菌的生態適應性和毒力進化，提高昆蟲病原真菌對草地貪夜蛾的防效提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 供試蟲源和菌株培養

草地貪夜蛾幼蟲采集自廣東省廣州市白云區鐘落潭鎮廣東省農業科學院白云基地種植的粵甜28甜玉米（Zea mays L.）植株上，在實驗室用玉米葉和果穗飼養至化蛹，待其羽化產卵后建立實驗室種群作為供試蟲源。室內飼養條件為（26±1）℃，相對濕度60%～90% ，光周期L∶D=14 h∶10 h。

供試球孢白僵菌菌株GZSL-1和玫煙色蟲草菌株IFCF01保存于廣東省農業科學院植物保護研究所，于-80 ℃下保藏。菌株接種于薩氏（SDAY）培養基（葡萄糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，瓊脂20 g/L），于溫度（28±1）℃，相對濕度（70±5）%，全黑暗的恒溫培養箱中培養20 d后供試。

1. 2 接種及取樣方法

用滅菌軟毛筆將SDAY培養基上的供試菌株分生孢子粉刷入裝有滅菌0.05%吐溫-80溶液的燒杯（50 mL）中，經渦流振蕩，點樣血球計數板，配制濃度為1.0×107孢子/mL的孢子懸浮液，作為接種的菌液。每種菌株為1個處理，以滅菌0.05%吐溫-80溶液處理為對照。采用浸蟲法處理草地貪夜蛾幼蟲，選取個體大小一致的草地貪夜蛾2齡幼蟲，放入不同菌株孢子懸浮液浸漬10 s后挑出，置于濾紙上吸去多余水分，移至皿底墊有濕潤濾紙片的培養皿（d=7.5 cm）中集體飼養（5頭/皿）（王道通等，2020），皿內放入新鮮玉米葉供其取食。每個處理25頭幼蟲，3次重復，處理后的幼蟲置于人工氣候箱中飼養[溫度（26±1）℃，相對濕度（80±5）%，光周期L∶D=14 h∶10 h]，每天觀察幼蟲存活情況及感染病蟲的外部特征，將死亡幼蟲保濕培養，根據前期研究結果（雷妍圓等，2020a，2020b），分別于接種后第8、16、24、32、48、72和96 h依次取樣，將樣品置于2.5%戊二醛進行前固定。

1. 3 掃描電鏡樣品制備及觀察

取1.2中收集和固定好的感菌草地貪夜蛾幼蟲，用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次;1%鋨酸后固定，再次用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次;然后以50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇梯度脫水，以醋酸異戊酯過渡，最后將樣品置于臨界點干燥儀干燥，再將干燥好的樣品粘臺，以離子濺射儀噴金鍍膜，在掃描電鏡（S-3400N，Hitachi）下觀察拍照。

1. 4 分生孢子生長參數測量及數據處理

當分生孢子的芽管長度與分生孢子寬度相等時，視為分生孢子已萌發（Safavi et al.，2007）。當牙管末端膨大達芽管寬度的1.5倍以上時，即視為形成附著胞。穿透芽管的長度為從分生孢子萌發點到寄主表皮穿透點間的長度。各菌株接種后16 h，分別在草地貪夜蛾幼蟲體表不同結構區統計萌發孢子數、附著胞形成數和孢子總數，計算孢子萌發率和附著胞率，每個結構區選取25個分生孢子，每株菌株處理重復3頭幼蟲。接種后32 h，測量不同菌株處理的幼蟲體表不同結構區內穿透芽管長度，在電鏡視野下于蟲體每種結構區內隨機測量5個分生孢子，同一種結構區共計15個，每種菌株處理重復3頭幼蟲。

試驗數據經Excel 2013整理后，使用SPSS 20.0進行處理分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性分析及Tukey HSD事后檢驗（α=0.05）。

2 結果與分析

2. 1 草地貪夜蛾幼蟲體表構造特點

在電鏡視野下，草地貪夜蛾幼蟲不同部位體表外形構造存在較大差異，根據外形結構特征，將其分為瘤狀突起結構區和平緩結構區2類（圖1）。瘤狀突起結構區包括體節背、腹面及靠近剛毛窩、氣門的區域，其特點是體表由許多排列較規則的瘤狀或刺瘤狀突起構成，突起基部明顯分離，突起間存在短距離的平緩區域，平緩區域大小和瘤的長度因具體部位而異（圖1-A）。平緩結構區包括頭殼、背板、胸足、腹足、臀足、足節間膜、足末端、趾鉤、氣門、剛毛窩、剛毛表面和臀節等區域，其特點是表面平滑或僅有微小起伏（圖1-B）。

2. 2 球孢白僵菌和玫煙色蟲草在草地貪夜蛾幼蟲體表附著和萌發

電鏡視野下，2種病原真菌的分生孢子均能附著在草地貪夜蛾幼蟲體表不同區域，包括剛毛（圖2-A）、剛毛窩（圖2-A）、氣門內（圖2-B）及胸足（圖2-C）等部位。2株菌株表現出較為相似的孢子萌發行為。接種菌株GZSL-1和IFCF01后，孢子分別在16和8 h萌發（圖2-A）。孢子萌發過程中產生2種類型的芽管。第1種，分生孢子的芽管頂端膨大產生附著胞結構（圖2-D和圖2-G），緊緊固著在幼蟲表皮上;芽管具有向幼蟲體表定向生長的能力，并進一步發育形成單芽管（圖2-E和圖2-H）。第2種，孢子萌發后形成雙芽管（圖2-F和圖2-I），芽管沿著表皮生長較長，且在菌株IFCF01的芽管上還觀察到進一步出現分枝（圖2-I）。2種病原真菌的分生孢子和附著胞表面皆可見黏液層（圖2-D和圖2-G）。

2. 3 球孢白僵菌和玫煙色蟲草在草地貪夜蛾幼蟲體表的菌絲生長及穿透過程

菌株GZSL-1和IFCF01均觀察到在草地貪夜蛾幼蟲體表各結構區上的穿透行為。如圖3所示，2種病原真菌分別在平緩結構區（圖3-A和圖3-D）和瘤狀突起結構區（圖3-B和圖3-E）以芽管直接穿透幼蟲表皮，或芽管以原有直徑延伸較長距離，形成菌絲并超過孢子縱軸長度，經幾次彎折沿幼蟲體壁方向定向生長，當到達適合入侵位置時，以菌絲直接穿透（圖3-C和圖3-F）。至接種后24 h，穿透行為普遍增多，在幼蟲體表各區域包括剛毛和剛毛窩附近也觀察到菌絲纏繞和穿透現象，芽管端部與幼蟲體壁接觸處可見黏液層（圖3-G）。隨著菌絲的生長，至接種后32 h，菌絲形成次級分枝進行穿透，穿透點可見穿透孔（圖3-H和圖3-I）。

2. 4 球孢白僵菌和玫煙色蟲草在草地貪夜蛾幼蟲體表的次級侵染

昆蟲病原真菌穿透草地貪夜蛾幼蟲表皮進入體內，蟲體內部提供的營養被大量消耗，菌體從幼蟲體內穿出，在體外繼續生長。至接種后48 h，2種病原真菌的菌絲體幾乎包圍了整個蟲體（圖4-A和圖4-D）;接種后72 h，可見初級分生孢子形成（圖4-B和圖4-E）。菌株GZSL-1分生孢子梗著生于營養菌絲上，產孢細胞在菌絲上簇生，基部為球形、近球形，產孢軸較長，軸上具小齒突，呈“之”字形彎曲（圖4-B）。菌株IFCF01的菌絲分隔，光滑;分生孢子梗直立，產生于菌絲上;瓶梗規則著生在分生孢子梗上，呈梭形，基部橢圓形膨大，向上逐漸變細形成一個細的頸部（圖4-E）。接種后96 h，新產生的分生孢子聚集成簇，此時2株菌株均出現二級至多級產孢。菌株GZSL-1分生孢子透明、光滑，球形或近球形，大小為1.94 ?m×1.62 ?m（圖4-C），菌株IFCF01分生孢子表面光滑，長橢圓形，大小為3.69 μm×1.20 μm（圖4-F）。

2. 5 球孢白僵菌和玫煙色蟲草在草地貪夜蛾幼蟲體表的生長指標

由圖5可知，2種昆蟲病原真菌在草地貪夜蛾幼蟲表皮各結構區均有較高的分生孢子萌發率（>90.00%），且菌株間無顯著差異（P>0.05，下同）（圖5-A）。與菌株GZSL-1相比，菌株IFCF01的附著胞率稍高，菌株GZSL-1和IFCF01在瘤狀突起結構區及平緩結構區的附著胞率分別為（85.33±2.31）%、（82.67±4.62）%和（92.00±6.93）%、（88.00±4.00）%，但2株菌株及各結構區間無顯著差異，均高于80.00% （圖5-B）。對不同結構區分生孢子萌發后形成的芽管穿透幼蟲體壁時的長度進行測量，結果表明2株菌株的穿透長度均以瘤狀突起結構區最長，平緩結構區的芽管最短。同時，菌株GZSL-1在各結構區形成的穿透芽管長度均短于菌株IFCF01相應的芽管長度，特別是在平緩結構區的芽管長度差異最大，顯著短于菌株IFCF01（P<0.05）（圖5-C）。

3 討論

昆蟲病原真菌侵染與寄主防御在恒定的相互選擇壓力下進行，兩者的相互作用有可能引起菌株變異、寄主范圍變化，以及（低毒）菌株經由寄主“繼代”時出現毒力增強（即復壯）的現象。寄主表皮作為蟲菌互作的第一個接觸點和屏障，對整個侵染過程起決定性作用，即最終決定菌體成功感染或寄主成功抵御真菌（Ortiz-Urquiza and Keyhani，2013）。前人研究表明，寄主表皮結構對昆蟲病原真菌的附著萌發和致病性有重要影響（Butt et al.，1995）。王音等（2005）報道金龜子綠僵菌入侵小菜蛾有利部位為表皮平緩結構區的足部與頭殼部位，其分生孢子在頭殼萌發后芽管能立即膨大形成附著胞直接刺入，而在表皮起伏變化大的嵴狀突起結構區，芽管無法迅速發現合適的附著和穿透區域，需經較長時間定向生長才會發生穿透或依表皮結構形成附著胞后穿透，因而從該類區域入侵時間較平緩區略為滯后。另有不同觀點認為，昆蟲的幼蟲頭殼強烈骨骼化，該區域表皮結構光滑且堅硬，不利于分生孢子附著。幼蟲蛻皮從頭部開始，孢子如未能及時附著，即首先被脫去，因而頭殼并非入侵最有利的薄弱部位。而在表皮有突起的結構區，這些突起恰好成為卡住孢子的良好構造，可在一定程度上防止孢子掉落，反而有利于分生孢子附著和侵染（Lei et al.，2021）。蛻皮作為昆蟲的一種自我防御，可最大限度降低分生孢子在其表皮上定殖。作為回應，真菌必須快速萌發穿透，以逃避寄主的防御行為反應。從本研究結果來看，2種昆蟲病原真菌的分生孢子均觀察到高密度分布在草地貪夜蛾幼蟲體表瘤狀突起結構區和平緩結構區，說明菌株對草地貪夜蛾幼蟲體壁具有無差別性的迅速侵染能力，可攻擊的位點較多，很可能是2株菌株對草地貪夜蛾致病力較強且致病速度較快的原因之一（雷妍圓等，2020a，2020b）。

根據侵染過程的時間軸，分生孢子在寄主體表的附著和萌發，是昆蟲病原真菌成功侵染的先決條件。分生孢子萌發主要受3個因素影響：（1）較高的濕度（Liu and Stansly，2009）;（2）遇到適合的寄主體壁，因為只有在特異性寄主的體壁上才有刺激孢子萌發的物質（Gillespie et al.，2002）;（3）必須克服昆蟲體壁上某些物質如抗菌肽、脂肪酸等的抑菌作用（Latgé et al.，1987）。附著胞的產生是大部分昆蟲病原真菌在寄主上定殖的前提，對于建立病原與寄主間的關系極其重要。有研究表明分生孢子在寄主表皮上的附著能力越強，其致病力也越強（Altre et al.，1999）。也有研究認為孢子對寄主的致病力與孢子的萌發率、附著數量和附著胞形成之間無相關性，而是取決于侵染速度（Ibrahim et al.，2002;Ment et al.，2010）。據報道，在煙粉虱（Bemisia tabaci）若蟲不同表皮結構區域觀察到球孢白僵菌分生孢子不同的萌發行為，在某些區域，孢子多為單向萌發，而另一些區域則出現單、雙向萌發，不同結構區域表皮理化特性與分生孢子間的作用，導致這種不同的萌發反應（Liu et al.，2010）。從本研究來看，2株菌株的分生孢子均能產生單芽管或雙芽管，均可形成附著胞結構，且單、雙芽管在各結構區皆有分布，并無特定的選擇偏好性，亦表明附著胞的形成為非專化性，這是否可以認為是菌株的一種高效侵染策略仍有待進一步研究。還有研究表明，單向萌發的分生孢子能產生強壯的芽管，且大多發育為附著胞結構，而雙向萌發的分生孢子則更傾向于生長為無穿透行為的菌絲，這種不同的萌發極性可作為致病力的一個指標（Talaei-Hassanloui et al.，2007）。本研究觀察到的單附著胞現象與上述萌發方式較為吻合，也與Ghaffari等（2017）的報道一致，2株菌株均未出現雙附著胞，且單附著胞均由單向萌發的芽管形成，雙向萌發的芽管未出現穿透行為，而是通過芽管進一步延長，在草地貪夜蛾幼蟲表皮上形成菌絲網絡結構。此外，電鏡視野下，2株菌株在草地貪夜蛾幼蟲表皮附著部位的附著胞分泌黏液物質，提示寄主表皮的成分刺激了分生孢子活化，幫助其在體壁上附著，提供有利于胞外酶活動的環境，在穿透寄主表皮過程中發揮活性（Safavi，2010;Khan et al.，2016）。

分生孢子在寄主體表穿透的速度及數量，是昆蟲病原真菌在寄主體表成功定殖和致病寄主昆蟲的關鍵環節（Lei et al.，2021）。綠僵菌分生孢子通常以附著胞結構對寄主表皮進行穿透（St. Leger et al.，1991;樊美珍和李增智，1994）。而本研究中2株菌株均可以附著胞、芽管或菌絲等形式直接穿透草地貪夜蛾幼蟲表皮，其入侵形式較多，很可能是影響其致病效率的因素之一。草地貪夜蛾幼蟲體表不同結構區對附著胞的產生和穿透菌絲的長度有一定影響。2株菌株在草地貪夜蛾幼蟲體表各結構區萌發后芽管末端很快膨大形成附著胞，或以芽管直接入侵，其萌發率和附著胞率均較高。該結果進一步證實了Butt等（1995）報道的菌株致病力不僅取決于孢子的萌發，還有分生孢子在體表上的附著力。但并不是所有的昆蟲病原真菌都必須產生附著胞后才能侵染寄主昆蟲。如金龜子綠僵菌在辣根猿葉甲（Phaedon cochleariae）和油菜金頭跳甲（Psylliodes chrysocephaIa）體表產生的附著胞比在桃蚜（Myzus persicae）和蘿卜蚜（Lipaphis erysimi）上的多，但在蚜蟲上即便沒有附著胞產生，萌發的芽管同樣也能侵入蚜蟲表皮（Butt et al.，1995）;球孢白僵菌侵染馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）時通過附著胞和芽管穿透（Duan et al.，2017），但在侵染棉鈴蟲（Heliothis zea）時并沒有形成附著胞結構（Pekrul and Grula，1979）;玫煙色蟲草可以附著胞、芽管或菌絲等多種形式侵染小菜蛾（Lei et al.，2021）。此外，本研究還觀察到菌株IFCF01分生孢子可經由幼蟲體壁上的氣門進入。類似現象在球孢白僵菌對棉鈴蟲的侵染模式中也有報道（Pekrul and Grula，1979）。與之相反的是，關于球孢白僵菌對桑天牛（Apriona germari）的研究結果顯示氣門并非理想的突破口，因為氣門中的過濾結構成為阻止孢子進入的天然屏障（王曉紅等，2009）。

本研究的菌株GZSL-1和IFCF01在草地貪夜蛾2齡幼蟲體表萌發起始時間稍有差別，菌株IFCF01最早觀察到萌發是在接種后8 h，菌株GZSL-1是在接種后16 h ，但菌株GZSL-1在接種后24 h已有較多穿透體壁的行為發生，活躍穿透期在24～32 h，且在平緩結構區穿透表皮芽管長度顯著短于菌株IFCF01。菌株IFCF01在接種后32 h 才出現較多穿透行為，活躍穿透期為32～48 h，在各結構區穿透芽管長度較前者長。說明菌株GZSL-1比菌株IFCF01對草地貪夜蛾2齡幼蟲具有更快的侵染速度。此前關于2株菌株的生測結果（雷妍圓等，2020a，2020b）顯示，菌株GZSL-1對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的LT50比菌株IFCF01快0.55 d，與本研究的觀察結果相吻合。此外，對穿透寄主表皮的芽管長度測量結果表明，2株菌株均以平緩結構區的芽管最短，明顯短于瘤狀突起結構區，說明在該部分區域入侵所用的時間最短，速度最快。菌株能快速侵入幼蟲表皮平緩結構區的頭殼，意味著可迅速損傷幼蟲腦組織，破壞其神經系統，這有可能是2株菌株快速侵染寄主的策略之一

真菌對寄主的侵染主要有兩種機制，一種是穿透寄主表皮的機械壓力，如孢子萌發時芽管定向生長產生的壓力（Fang et al.，2009）;另一種是酶類物質對表皮的降解作用，如次級代謝物、胞外蛋白酶、幾丁質酶和酯酶等（Zhang et al.，2008;Safavi，2010;Staats et al.，2013;Khan et al.，2016）。前者由昆蟲病原真菌結構發揮作用，如本研究掃描電鏡觀察到的附著胞結構，后者仍有待進一步探究，以評估蟲體誘導下菌株產生的次生代謝物和酶類物質在侵染過程中所發揮的作用。另外，真菌對昆蟲控制能力強弱不僅體現在致病力上，其自然環境溫度、紫外線耐受性等因素均會影響田間防治效果。可以預期的是，昆蟲病原真菌的生活環境相似，自然條件下能混雜發生，如果幾種病原真菌能夠對同一生境內的害蟲同時起控制作用，勢必在生物防治中起事半功倍的作用。

4 結論

本研究結果在室內可控條件下獲得，2種病原真菌球孢白僵菌和玫煙色蟲草在草地貪夜蛾體表侵染模式觀察證實了菌株的高致病性，基本闡明了設置條件下菌株分生孢子侵染草地貪夜蛾幼蟲的表觀過程，為廣東本地的草地貪夜蛾生防真菌球孢白僵菌菌株GZSL-1和玫煙色蟲草菌株IFCF01的改良和田間應用打下理論基礎。

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（責任編輯 麻小燕）