lncRNA SNHG6調控miR-335-3p/PDCD4途徑對缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷的影響

尤其 郭輝

溶栓、經皮冠狀動脈介入治療是心肌梗死后恢復血供的有效方法，但隨著血供恢復會造成額外的心肌損傷，即心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。因此，減輕I/R損傷對改善心肌梗死患者預后具有重要意義。近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）受到人們的關注，其通過與靶微小RNA（microRNA，miRNA）結合抑制miRNA對靶mRNA表達的負調控，具有多種生理和病理功能[1]。目前，已有多種lncRNA參與心肌I/R損傷的調控[2-3]。研究報道，在缺血性腦卒中體內外模型中lncRNA小核RNA宿主基因6（small nuclear RNA host gene 6，SNHG6）表達增加，抑制SNHG6表達可提高神經元細胞活力，抑制氧糖剝奪誘導的細胞凋亡，減少腦梗死面積，并改善神經系功能[4]。然而，SNHG6在心肌I/R損傷中的作用并不清楚。DIANA工具預測到微小RNA-335-3p（microRNA-335-3p，miR-335-3p）與SNHG6存在特異結合位點。已有研究表明，在小鼠局灶性腦I/R模型中，敲除環狀RNA絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1（circular RNATousled-like Kinase1，circTLK1）通過上調miR-335-3p表達減少梗死體積，可減輕神經元損傷，改善神經功能缺損[5]。Targetscan預測到程序性細胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）與miR-335-3p存在特異結合位點，在I/R心肌細胞中PDCD4表達上調，下調PDCD4可增強心肌細胞活力，促進細胞周期進程，抑制細胞凋亡[6]。但SNHG6/miR-335-3p/PDCD4分子軸在心肌I/R損傷中的作用尚未闡明。本研究旨在研究SNHG6在心肌I/R損傷中的作用，并通過miR-335-3p/PDCD4進一步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和儀器 大鼠心肌細胞系H9C2購自中國武漢典型培養物保藏中心；杜爾伯格氏伊戈爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）及胎牛血清購自美國Gibco公司；SNHG6小干擾RNA（si-SNHG6）、miR-335-3p模 擬 物（mimics）、miR-335-3p抑制物（anti-miR-335-3p）以及相應陰性對照（si-NC、miR-NC、anti-miR-NC）購自北京六合華大基因公司；miRNA提取試劑盒（200116）購于北京天根生化科技公司；M-MLV逆轉錄酶（200101）購自美國Life Technologies公司；SYBR Green PCR Master Mix（191028）購自美國ABI公司；miRNA反轉錄試劑盒（190812）、miRNA檢測試劑盒（191201）、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin-V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（191011）購自北京百奧萊博生物公司；小鼠PDCD4單克隆抗體（sc-376430）、小鼠磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（sc-47724）、羊抗鼠IgG二抗（sc-2005）購自美國Santa Cruz公司；鼠源裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）多克隆抗體（ab2302）、羊抗兔IgG二抗（ab97051）購于美國Abcam公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（190911）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（191005）購自北京索萊寶生物公司；雙熒光素酶活性測定試劑盒（200201）購自北京天恩澤基因科技公司。熒光定量PCR儀（7500型）購自美國ABI公司；流式細胞儀（FACSCalibur）購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染和分組 細胞培養：參照李瑞萍等[7]實驗方法建立心肌細胞缺氧復氧損傷模型，H9C2細胞接種于無血清低糖（糖濃度1.0 g/L）DMEM培養液，放入缺氧培養箱（95%N2，5%CO2）培養3 h，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM高糖（糖濃度4.5 g/L）培養液，放入正常培養箱（95%空氣，5%CO2）復氧培養6 h。細胞轉染：將對數期H9C2細胞以2×105個/孔接種于6孔板。利用脂質體Lipofectamine 2000將si-SNHG6、si-NC、miR-335-3p mimics、miR-NC、si-SNHG6+anti-miR-NC、si-SNHG6+anti-miR-335-3p分別轉染匯合度為60%的H9C2細胞，收獲轉染48 h細胞。分組：對照組為正常培養的H9C2細胞；模型組為缺氧處理3 h、復氧處理6 h的H9C2細胞；模型+si-NC組、模型+si-SNHG6組、模型+miR-NC組、模型+miR-335-5p組分別為轉染si-NC、轉染si-SNHG6、轉染miR-NC、轉染miR-335-5p mimics的H9C2細胞（缺氧處理3 h、復氧處理6 h）；模型+si-SNHG6+anti-miR-NC組、模型+si-SNHG6+anti-miR-335-5p組分別為轉染si-SNHG6與anti-miR-NC、轉染si-SNHG6與anti-miR-335-5p的H9C2細胞（缺氧處理3 h、復氧處理6 h）。

1.2.2 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測SNHG6、miR-335-3p表達TRIzol試劑盒、miRNA提取試劑盒分離H9C2細胞的總RNA和miRNAs。M-MLV逆轉錄酶合成cDNA，再用SYBR Green PCR Master Mix進行熒光定量PCR以檢測SNHG6表達水平。采用miRNA反轉錄試劑盒合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用miRNA檢測試劑盒進行熒光定量PCR以檢測miR-335-3p表達水平。SNHG6、miR-335-3p分別以GAPDH和U6作 為 內 參 對 照，2-ΔΔCt法 計 算SNHG6、miR-335-3p表達量。引物序列如下（5'-3'）：SNHG6上游ATACTTCTGCTTCGTTACCT，下游CTCATTTTCATCATTTGCT；GAPDH上游GGGAGCCAAAAGGGTCATCA，下游TGATGGCATGGACTGTGGTC；miR-335-3p上游UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC，下游CCAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC；U6上游CTCGCTTCGGCAGCACA，下游AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡H9C2細胞處理完畢后，收集細胞，PBS洗滌細胞2次，并用結合緩沖液重懸細胞。取100 μL細胞懸液（細胞數約1×105個），加入Annexin-V-FITC和PI各5 μL，暗室內孵育30 min后添加400 μL結合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比。

1.2.4 分光光度法檢測細胞中SOD活性、MDA水平 缺氧復氧處理結束后，收集細胞至離心管，加入提取液超聲破碎細胞，收集上清液，按照商品試劑盒說明書測定SOD活性、MDA水平。

1.2.5 蛋白質印記法檢測PDCD4和Cleaved Caspase-3蛋白表達 放射免疫沉淀試驗（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取H9C2細胞總蛋白。取等量的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，封閉膜后與特異性一抗（PDCD4和GADPH均 為1∶300稀 釋，Cleaved Caspase-3為1∶500稀釋）在4℃孵育過夜。室溫下將膜與對應二抗孵育1 h。將膜置于孵育盒，滴加化學發光試劑暗室顯影。Image-Pro Plus 6.0軟件分析PDCD4蛋白條帶和GADPH條帶灰度值，二者的比值表示PDCD4蛋白表達量。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-335-3p結合位點的野生型（wild type，WT）或突變型（mutant type，MUT）SNHG6或PDCD4-3'-UTR序列克隆至psiCHECK-2載體，構建熒光素酶報告質粒WTSNHG6、MUT-SNHG6、WT-PDCD4、MUT-PDCD4。利用脂質體轉染法將上述報告質粒分別與miR-335-3p mimics（miR-335-3p組）、miR-NC（miR-NC組）轉染H9C2細胞，雙熒光素酶活性測定試劑盒分析轉染48 h后各組細胞相對熒光素酶活性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件，正態分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞SNHG6、miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3表達水平及凋亡等指標的比較 見圖1、表1。

由圖1、表1可見，與對照組比較，模型組SNHG6表達量，PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達量，細胞凋亡率及MDA水平均顯著升高（均P＜0.01），miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著降低（均P＜0.01）；與模型+si-NC組比較，模型+si-SNHG6組SNHG6表達量，PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達量，細胞凋亡率及MDA水平均顯著降低（均P＜0.01），miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著升高（均P＜0.01）。

表1 各組細胞SNHG6、miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3表達水平及凋亡等指標的比較

圖1 干擾SNHG6對細胞凋亡流式圖及PDCD4蛋白表達電泳圖的影響

2.2 雙熒光素酶報告實驗結果DIANA工具預測到miR-335-5p與SNHG6序列存在連續特異性結合位點，Targetscan預測到miR-335-5p與PDCD4-3'-UTR區域存在連續特異性結合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-335-5p組WT-SNHG6、WT-PDCD4的相對熒光素酶活性均顯著下降（均P＜0.01），而MUT-SNHG6、MUT-PDCD4的相對熒光素酶活性差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 雙熒光素酶報告實驗結果

圖2 小核RNA宿主基因6（SNHG6）、微小RNA（miR）-335-5p和程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）的互補序列

2.3 各組細胞miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平及凋亡等指標的比較 見圖3、表3。

由圖3、表3可見，與模型+miR-NC組比較，模型+miR-335-5p組miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著升高（均P＜0.01），PDCD4和Cleaved Caspase-3蛋白表達量、細胞凋亡率、MDA水平均顯著降低（均P＜0.01）。

表3 各組細胞miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平及凋亡等指標的比較

圖3 微小RNA（miR）-335-5p對細胞凋亡流式圖及程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）蛋白表達電泳圖的影響

2.4 各 組 細 胞miR-335-5p、PDCD4、CleavedCaspase-3表達及凋亡等指標的比較 見圖4、表4。

由圖4、表4可見，與模型+si-SNHG6+antimiR-NC組比較，模型+si-SNHG6+anti-miR-335-5p組miR-335-5p表達量、SOD活性均顯著降低（均P＜0.01），PDCD4和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平及細胞凋亡率、MDA水平均顯著升高（均P＜0.01）。

表4 各組細胞miR-335-5p、PDCD4、Cleaved Caspase-3表達及凋亡等指標的比較

圖4 抑制微小RNA（miR）-335-5p可逆轉干擾小核宿主基因6（SNHG6）對凋亡流式圖及程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）蛋白表達電泳圖的影響

3 討論

lncRNA通過調控基因表達參與心肌I/R損傷的多種病理過程，具有作為心肌I/R損傷治療靶點的潛力。Du等[8]研究指出lncRNA核富集轉錄體1（NEAT1）/miRNA-520a軸參與心肌I/R損傷中線粒體途徑細胞凋亡的調控。Xue等[9]的研究表明，lncRNA低氧誘導因子1α反義RNA1（HIF1AAS1）通過吸附miRNA-204調節信號轉導蛋白抑制因子2表達參與心肌I/R損傷后心室重構。Liang等[10]報道抑制lncRNA ROR可減弱缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應。然而，SNHG6在心肌I/R損傷中功能并未闡明。已有文獻證實SNHG6在結直腸癌、乳腺癌等實體腫瘤中表達上調，具有致癌因子作用[11-12]。SNHG6表達增加還可能與室間隔缺損形成有關[13]。本研究證實缺氧復氧處理后H9C2細胞中SNHG6表達量明顯增加，提示SNHG6表達改變可能與心肌I/R損傷有關。功能實驗表明，轉染si-SNHG6干擾SNHG6表達顯著抑制缺氧復氧誘導的細胞凋亡，抑制Cleaved Caspase-3蛋白表達。心肌缺氧后，尤其在復氧階段產生大量的活性氧，SOD是清除活性氧的重要氧抗氧化酶，當機體氧化抗氧化失衡時導致活性氧攻擊生物膜誘導廣泛的氧化應激損傷[14-15]。本研究中干擾SNHG6表達后，缺氧復氧誘導H9C2細胞中SOD活力明顯增加，脂質過氧化終產物MDA水平明顯降低，說明干擾SNHG6表達能夠減弱缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激損傷。Shan等[16]證實在動脈粥樣硬化中，敲減SNHG6能夠提高人臍靜脈內皮細胞活力，減弱低密度脂蛋白誘導的氧化應激、炎癥和細胞凋亡，這與本研究中干擾SNHG6表達的保護作用一致。以上數據表明，SNHG6可能參與心肌I/R損傷。

研究表明lncRNA通過表觀遺傳、轉錄或翻譯機制參與人類心血管疾病進展[17]。對SNHG6進行分析發現其功能的發揮多與調控miRNA表達有關，例如SNHG6通過靶向miR-101-3p參與膠質瘤細胞的增殖、上皮-間充質轉化和遷移，抑制細胞凋亡[18]。SNHG6靶向miR-26a-5p調控結直腸癌細胞的5-氟尿嘧啶耐藥性[19]。本研究通過熒光素酶實驗證實SNHG6與miR-335-3p直接存在相互作用，進一步研究顯示缺氧復氧處理后H9C2細胞中miR-335-3p表達明顯降低，而干擾SNHG6表達顯著減弱缺氧復氧對miR-335-3p表達的抑制作用，提示SNHG6可能靶向miR-335-3p參與心肌I/R損傷。轉染miR-335-3p mimics進行功能實驗，結果表明過表達miR-335-3p顯著減輕缺氧復氧誘導的H9C2細胞凋亡和SOD活力下降，下調Cleaved Caspase-3蛋白表達并降低MDA水平，這與Wu等[5]報道的miR-335-3p在腦I/R損傷中的保護作用一致。miRNA主要通過識別靶mRNA抑制其翻譯來調控蛋白表達進而發揮作用。PDCD4是細胞凋亡的關鍵介質，正常心肌組織中PDCD4表達水平較低，過氧化氫或缺氧復氧處理后心肌細胞中PDCD4表達上調可加重細胞凋亡，通過下調PDCD4表達可改善過氧化氫誘導的心肌細胞損傷和心肌I/R損傷[20-22]。本研究發現缺氧復氧處理后H9C2細胞中PDCD4表達增加，并證實PDCD4是miR-335-3p的靶基因，且干擾SNHG6或過表達均可減弱缺氧復氧處理對PDCD4表達的促進作用，這說明SNHG6/miR-335-3p/PDCD4途徑可能在心肌I/R損傷中發揮作用。回復實驗顯示，抑制miR-335-3p表達顯著減弱干擾SNHG6表達對H9C2細胞缺氧復氧損傷的影響，這說明SNHG6通過靶向miR-335-3p進而上調PDCD4表達參與缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷。

總之，本研究證實干擾SNHG6表達通過上調miR-335-3p/PDCD4途徑能夠減弱缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷，這進一步揭示了心肌I/R損傷中lncRNA/miRNA/mRNA調控機制，為心肌I/R損傷提供潛在治療靶點。