葡萄灰霉病病原菌鑒定及天然藥物的抑制效果評價

張威，周勇,2,3*，彭言劼,2,3，劉忠,2,3，鄭英

（1. 樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000；2. 樂山師范學院峨眉山研究院，四川樂山 614000；3. 峨眉山生物多樣性保護與利用研究所，四川樂山 614000；4. 樂山市農業科學研究院，四川樂山 614000）

葡萄是世界四大水果之一，在我國具有悠久的種植歷史，且總產量位于世界首位[1]。我國南方地區日照充足，雨量充沛，在鮮食葡萄生產中具有顯著的地域優勢。四川盆地作為南方葡萄的主要產區，在鮮食葡萄生產中發揮著重要作用。但四川盆地高溫高濕的氣候環境易誘發葡萄病蟲害的發生[2]，其中灰霉病是威脅葡萄生產的主要病害之一[3]。葡萄灰霉病病原菌為葡萄孢屬真菌，其侵染植株后，引起植株體細胞程序性死亡，從而破壞組織正常生長，屬于植物致病的死體營養型病原真菌類型[4]。早期報道的葡萄孢屬真菌只有Botrytis cinereaPers，近年來又陸續發現能侵染葡萄的致病新種Botrytissp.2[5]、Botrytis pseudocinerea[6]、Botrytis sinoviticola[7]和Botrytissp. B83[8]。這些葡萄孢屬新種在形態學上存在一定差異，并且對不同葡萄品種的致病力分化嚴重，感病品種發病常會造成大幅減產甚至絕產。

生產上對葡萄灰霉病的防治大多采用化學藥劑方法[9]，易造成農殘超標和環境污染，且化學藥劑的作用機理單一，防治效果不理想等。據報道，目前已發現灰霉病病原菌對多菌靈、甲基托布津、腐霉利、異菌脲、咯菌腈、啶酰菌胺等殺菌劑產生了不同程度的抗性，且部分能穩定遺傳，甚至出現了多重抗藥性或防效接近喪失的情況[10-16]。因此，研發高效、廣譜、抗性持久、環境友好的殺菌劑是葡萄灰霉病防治中亟須解決的重要問題[17]。近年來，生物源農藥因其環境友好、殺菌譜廣、不易產生抗性等特點被廣泛應用于植物病蟲害防治。其中，植物源農藥在病害防控方面的優勢正日益受到人們的廣泛重視。目前已發現藥用植物飛廉、石菖蒲、冬凌草、黃連、黃芩等[18-21]的提取物和紅蓼揮發油[22]可有效防治黃瓜枯萎病、番茄灰霉病、蘋果青霉病、魔芋軟腐病、馬鈴薯環腐病等多種植物病害，但在利用植物源制劑對葡萄灰霉病防治方面鮮見報道。

本研究對四川成都葡萄產區田間灰霉病病原菌進行分離和鑒定，并探究了該病原菌對11個葡萄品種的致病力，同時利用藥用植物提取液對葡萄灰霉病病原菌進行抑菌研究，旨在為該區域葡萄品種的產業布局、病害防治和天然藥物開發等提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

葡萄灰霉病病原菌采自四川成都葡萄產區（雙流）灰霉病染病葡萄植株。用于灰霉病病原菌致病力鑒定的11個葡萄品種為‘巨峰’‘夏黑’‘巨玫瑰’‘陽光玫瑰’‘維多利亞’‘黑巴拉多’‘美人指’‘寒香蜜’‘醉金香’‘紫甜’‘SO4’，采自四川省樂山市夾江縣葡萄產區。

供試藥材防己、苦地丁、金銀花、海金沙、藿香、鉤藤、黃連、黃苓、丁香、細辛、柴胡、荊芥、肉桂、小茴香、蒼術、艾葉、辛夷、石榴皮、蛇床子、厚樸、千里香、金櫻子、石菖蒲、大黃、苦參、青蒿，共26種，采購于樂山德盛堂大藥房和文澤軒中藥材店。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離及形態學觀察

采集四川成都雙流葡萄產區內6個種植基地表現典型灰霉病癥狀的葡萄果穗，用無菌保鮮袋密封后帶回實驗室。灰霉病病原菌的分離、純化、培養參考方中達[23]的方法；再將病原菌菌株沿菌落邊緣打取菌餅（直徑5 mm）倒置轉接于PDA培養基，黑暗恒溫20 ℃培養，逐日觀察記錄分生孢子梗、分生孢子、菌核的形態特征。

1.2.2 葡萄灰霉病病原菌致病力檢測

病原菌致病性檢測參考離體葉片接種法[24]。2021年4月，采取供試品種當年生枝條上第3～5片成齡葉片，每品種選取3片葉，用無菌水清洗3次后擦干，置于鋪有濕潤濾紙的150 mm培養皿中，用針刺法在葉片中間接種部位制造3處傷口（避開葉片的主脈刺傷），取培養3 d的菌餅（直徑5 mm）接種于離體葉片正面的傷口部位，以接種空白瓊脂塊為對照，每個葉片接種3處，同時設3個生物學重復。置于條件為20 ℃、100%相對濕度、16 h光照、8 h暗光的培養箱內培養。在接種后第3天和第6天統計發病情況，用十字交叉法測量病斑直徑。并對發病葉片再次進行病原菌分離培養，觀察菌落形態。

1.2.3 病原菌的SCAR標記檢測

病原菌采用T5 Direct PCR Kit (Plus)（北京擎科）進行直接擴增，SCAR標記檢測參考范璇[25]的方法，特異性引物（北京擎科）序列如表1所示。PCR擴增體系50 μL：包含DNA模板2 μL，2×T5 Direct PCR Mix(Plus)；上下游引物各2 μL（10 μmol/L）；最后用ddH2O補充至50 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，56.7 ℃/59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共37個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，TS-GelRed核酸染料（北京擎科）進行染色，凝膠成像。

表1 葡萄灰霉病病原菌分子鑒定所用SCAR引物Table 1 SCAR primers for molecular identification of pathogen of grey mold in grapes

1.2.4 中草藥提取液的制備

將26種中草藥分別磨碎，各稱取10 g，用80%乙醇50 mL浸泡，35 ℃、150 r/min恒溫振蕩提取48 h后，室溫下4000 r/min離心6 min，提取母液，于5 ℃暗處儲存備用。最終中草藥浸提液的濃度為200 mg/mL[26]，并計算提取效率。

提取效率（mL/g）＝提取母液量/稱取中藥材的量[21]

1.2.5 醇提物抑菌活性的測定

用接種環將培養3 d的菌株轉移至試管中，加入無菌水，稀釋成濃度為1×105cfu/mL的菌液。抑菌活性采用瓊脂擴散法進行測定[27]，即移取150 μL菌液，用涂布器將其均勻涂布于PDA培養基上，再在培養基上打3個孔，孔徑為85 mm，將中藥提取物注入孔中，加滿且不得溢出。以80%乙醇作為對照（CK），每組重復3次。將培養皿置于25 ℃恒溫箱中培養48 h后，用游標卡尺測量記錄抑菌圈直徑。

1.2.6 醇提物MIC值及EC50值測定

采用菌絲生長速率法進行測定[28]。選取抑菌效果最佳的2種植物提取物，采用二倍稀釋法依次將其稀釋為最終濃度16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 mg/mL的含藥平板，每組接種一塊直徑5 mm的菌餅，每組重復3次，置于25 ℃恒溫箱中培養。用十字交叉法測菌落直徑，菌絲不生長的最低濃度為提取物對病原菌的最低抑菌濃度（MIC）。計算不同時間（48 h/72 h）的抑制率，在DPS軟件中求出毒力回歸方程（y＝a＋bx）、抑制中濃度EC50以及相關系數。

抑菌率＝(對照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑－菌餅直徑)×100%

1.2.7 數據處理

數據整理用Excel 2010，顯著性檢驗在DPS數據處理系統中進行，多重比較用Duncan's新復極差法（SSR法）。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態觀察及鑒定

在PDA培養基上，葡萄灰霉病病原菌落形態呈絮狀，形成大量氣生菌絲。隨培養天數增加，菌絲由白色逐漸轉變為灰褐色，后期形成不規則狀的黑褐色菌核，主要分布于培養皿邊緣。灰葡萄孢分生孢子梗尖端呈不對稱分叉，末端膨大，著生無色至淺褐色的分生孢子，孢子呈橢圓形或卵形，成熟后似葡萄穗狀。菌絲自分生孢子梗處延續生長，可成串。

將分離所得灰霉菌菌株用刺傷接種法接種到新鮮健康的葡萄葉片上，6 d后可觀察到接種部位出現淡黃褐色“V”字病斑，病斑邊緣不規則，表面生有少量霉狀物，發病癥狀與田間自然條件下一致。再對發病的葡萄葉片進行病原菌取樣再分離，所得菌株形態與原接種菌落形態相同，由柯赫氏法則確定分離的菌株為葡萄灰霉病病原菌。

利用SCAR標記對分離的葡萄灰霉病病原菌進行檢測，引物ITS-1/ITS-4、Bc-f/Bc-r、Bps-f/Bps-r、Bsa-f/Bsa-r、Bsp2-f/Bsp2-r檢測所分離的菌株，只有真菌通用性引物ITS-1/ITS-4和Bc-f/Bc-r引物擴增出目標條帶，且片段與預期大小一致，其它引物未擴增出任何片段。結合病原菌的菌落形態特征和SCAR標記檢測結果，確定在四川成都葡萄產區所分離到的葡萄灰霉病病原菌均為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。

圖1 葡萄灰霉病病原菌的形態及鑒定Figure 1 Morphology and identification of pathogens of grey mold in grape

2.2 致病力鑒定

將灰葡萄孢離體接種不同品種新鮮葡萄葉片，依據葉片上所形成的病斑大小來判斷該菌株的致病力強弱。如表2所示，該菌種對不同葡萄品種的致病力存在差異。在第3天，該菌種對‘黑巴拉多’葡萄致病力最強，平均病斑直徑為8.233 mm，極顯著強于其它品種；其次是‘寒香蜜’‘SO4’‘紫甜’‘維多利亞’‘陽光玫瑰’，平均病斑為6.144～6.833 mm。該病原菌對以上5個品種致病力無顯著差異，但極顯著強于‘巨峰’‘美人指’和‘醉金香’；而對‘夏黑’和‘巨玫瑰’無明顯致病效果。在第6天，該菌種對‘黑巴拉多’‘紫甜’‘寒香蜜’‘SO4’和‘陽光玫瑰’致病力較強，病斑直徑為7.267～9.500 mm，均極顯著強于其它品種；其次是‘維多利亞’‘美人指’‘巨峰’‘醉金香’和‘夏黑’，對這5種品種的致病力顯著強于‘巨玫瑰’；而對‘巨玫瑰’無明顯致病性。

表2 灰葡萄孢菌對11個葡萄品種的致病力比較Table 2 Comparison of pathogenicity of Botrytis cinerea against 11 grape varieties mm

2.3 中藥提取物對灰葡萄孢的抑制效果

不同植物提取物對灰葡萄孢抑菌效果差別較大，如表3所示。其中，有8種植物具有較強的抑菌活性，其中丁香、厚樸醇提物抑菌效果最好，平均抑菌圈直徑分別為49.50、46.07 mm，極顯著優于其它中藥醇提物及對照；黃連和穿心蓮醇提物效果次之，平均抑菌圈為20.70、17.57 mm，二者存在顯著差異，但均極顯著優于其它中藥醇提物及對照；辛夷花、石菖蒲、大黃、金櫻子醇提物抑菌效果差異不顯著，均有較強抑菌效果；而苦地丁、荊芥、防己、小茴香醇提物對灰葡萄孢無明顯抑制作用。從提取率看，2種具有最好抑菌效果的藥材丁香、厚樸同時具有較高的提取率，為2.87～3.18 mL/g，經濟性較好。

表3 26種中藥醇提取物對灰葡萄孢的抑制作用Table 3 Inhibitory effects of alcohol extractions of 26 Chinese herbs on Botrytis cinerea

2.4 丁香、厚樸梯度濃度醇提物對灰葡萄孢的抑制效果

選取濃度梯度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的帶藥培養基，在48 h和72 h的菌絲生長數據進行統計分析，分別求出MIC值、毒力回歸方程和抑制中濃度（EC50），結果見表4。在48 h時，丁香和厚樸對灰葡萄孢的EC50分別為0.218、0.420 mg/mL，MIC值分別為2、8；而72 h時，EC50分別為0.291、0.741 mg/mL，MIC值分別為2、16 mg/mL，因此丁香稀釋后藥效保持度優于厚樸，經濟效益較高。兩種中藥醇提物在48 h作用于灰葡萄孢菌絲的生長情況見圖2。

表4 丁香、厚樸醇提物對灰葡萄孢的毒力方程及MIC值Table 4 Toxicity equation and MIC of alcohol extractions of Clove and Magnolia to Botrytis cinerea

圖2 丁香、厚樸梯度濃度醇提物對灰葡萄孢菌絲生長的影響（48h）Figure 2 Effects of alcohol extractions of clove and magnolia officinalis at gradient concentration on mycelial growth of Botrytis cinerea（48h）

3 討論

該研究根據柯赫氏法則、病原菌菌絲和菌核形態特征及SCAR標記檢測，對四川成都葡萄產區灰霉病病原菌進行了鑒定，確定所分離到的灰霉病病原菌為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。灰葡萄孢腐生性強，寄主范圍廣，已報道的寄主就有235種[29]，且致病力差異大。Egashira等[29-30]發現，灰霉菌對栽培種番茄的致病力強于野生種，且隨著植株年齡的增大致病力增強，對同一植株的葉片致病力隨葉齡的增大而增強。寇宏達等[31]發現，不同菌株對同一葡萄品種的致病力不同，對不同葡萄品種的致病力也不同。本試驗對11個不同品種葡萄葉片進行致病力測定發現，該灰霉病病原菌菌株對不同葡萄品種的致病力差異較大，‘巨玫瑰’和‘夏黑’對葡萄灰霉病的抗性較強，‘黑巴拉多’則易感，因此對于‘黑巴拉多’的種植應做好清園工作，且在發芽前采取預防措施；部分品種第3天和第6天平均病斑直徑差異較大，這可能是不同品種葡萄對該灰霉病病原菌的抗性呈一定階段性，即可能在病程不同階段葉片內含物含量變化或分生孢子大量繁殖，導致抗性發生變化或致病力增強，因此對于‘維多利亞’‘寒香蜜’‘黑巴拉多’品種，若發現感病，應在初期及時進行防治，清除病葉和病穗，以防止病情蔓延。

灰霉病菌是一機會病原菌，作物種質資源中尚未發現抗病的材料，很難培育出抗病品種[32]。天然中藥材具有普通化學藥劑所不具備的高效抗菌、安全、無殘留等特點，能解決病原菌耐藥性、環境污染和農殘等問題。本研究測定了26種中藥醇提物對灰葡萄孢的抑制效果，結果發現，丁香、厚樸醇提物對灰葡萄孢具有極顯著的抑菌作用，其平均抑菌圈直徑分別為49.50、46.07 mm，48 h的EC50分別為0.218、0.420 mg/mL，且具有較高的提取效率（2.87～3.18 mg/mL），可作為制備防治葡萄灰霉病的植物源農藥材料。

本研究中的抑菌試驗僅限于26種中藥醇提物，有些中藥抑菌效果較差，可能是乙醇對中藥中有效成分提取有限，需選擇多種溶劑進行提取進一步確認；丁香、厚樸醇提物對灰葡萄孢抑菌效果較好，但尚不知其對葡萄生長的生理指標是否有影響；并且灰葡萄孢的致病力檢測均在離體條件下測定，未進行田間活體試驗。因此，更準確的結果需要擴大中藥品種篩選范圍，選出高效準確提取中藥活性物質的方式，在田間進行活體致病力檢測和抑菌試驗。