IGF1R反義非編碼RNA在肝癌中的差異化表達(dá)

謝志海，周志聰，桂 元，孫靜鋒

(1.廣州市老人院 老年病治療中心, 廣州 510000；2.江蘇省腫瘤醫(yī)院 肝膽胰外科, 南京 210013；3. 南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 腫瘤外科, 南京 210013)

胰島素樣生長(zhǎng)樣因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)作為胰島素生長(zhǎng)因子受體，其在人體發(fā)揮著重要的作用，然而，關(guān)于IGF1R基因失調(diào)對(duì)組織影響的分子機(jī)制知之甚少。在IGF1R基因內(nèi)部有一條跨過(guò)啟動(dòng)子，同IGF1R基因編碼方向完全相反的長(zhǎng)鏈非編碼RNA系列[1]。同我們通常所說(shuō)的長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(RNA)表達(dá)方式很不相同的是IGF1R的反義非編碼RNA在人體的乳腺組織、心肌肌纖維中呈印記表達(dá)(即父源等位基因表達(dá)，母源等位基因沉默)，國(guó)際上把該長(zhǎng)鏈非編碼RNA命名為IGF1R反義非編碼RNA(IGF1 receptor antisense imprinted noncoding RNA, IGF1RAIN RNA)[2]。IGF1RNA反義非編碼RNA基因在乳腺腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤以及肺部腫瘤中差異化表達(dá)同腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切[3-5]。我們通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)法比較IGF1RAIN RNA在肝癌癌瘤中、肝癌瘤旁組織及正常肝組織中的含量，對(duì)不同的肝癌分期及肝癌病理分期的肝癌組織中IGF1RAIN RNA含量進(jìn)行比較，分析IGF1RAIN RNA含量同肝癌的關(guān)系，驗(yàn)證其作為肝癌標(biāo)記物的可能性。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2017年1月-2020年6月手術(shù)切除的30例肝癌的癌組織及癌旁組織，癌旁組織定義為肝癌切緣外3 cm的肝組織，其中男19例，女11例, 年齡42～71歲，中位年齡63.75歲，腫瘤直徑1.0～8.0 cm，中位直徑5.8 cm。按照中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO)肝癌中國(guó)指南2018版臨床分期Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期12例；病理分級(jí)按WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：高分化肝癌10例，中分化肝癌8例，低分化肝癌12例。另取同期10例肝囊腫以及6例肝血管瘤手術(shù)切除標(biāo)本的切緣旁1 cm正常肝組織作為對(duì)照組。本研究經(jīng)過(guò)手術(shù)單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院(20200016)]，患者以及家屬簽署同意書(shū)準(zhǔn)予用于實(shí)驗(yàn)。30例肝癌患者術(shù)前均未行其他如化療、靶向、放療、免疫、中藥等治療。

1.2試劑與方法

1.2.1試劑 Tri-Reagent購(gòu)自Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇、美國(guó)ABI公司Power SYBR Green PCR Mastm’mix實(shí)時(shí)PCR試劑盒及ABI 7900HT 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)等。

1.2.2總RNA提取 (1)從液氮罐取出肝癌切除癌瘤標(biāo)本，迅速轉(zhuǎn)入保持低溫的研缽中研磨直到完全成粉狀后滴注1 ml的Trizol試劑裂解組織。(2)勻漿分相：將裂解的Trizol液1 ml轉(zhuǎn)移到1.5 ml的離心管中，20 ℃靜置5 min后向其中滴加三氯甲烷200 μl，混勻后繼續(xù)靜置3 min放置于離心機(jī)中，溫度4 ℃，轉(zhuǎn)速12 000 r/min條件下離心15 min。(3)RNA 沉淀：取400 μl離心后的上層清亮液體轉(zhuǎn)移到另一只清潔干燥的EP管中，向其中滴注異丙醇400 μl，經(jīng)過(guò)4 ℃條件下15 min靜置后，以10 000 r/min快速離心15 min。(4)洗滌沉淀：離心結(jié)束后摒棄上層清亮液體后注入75%的醇1 ml，上下快速甩動(dòng)EP管2次，4 ℃，以12 000 r/min離心5 min，再次摒棄上層清亮液體后將剩下的EP 管放置于清潔干燥的環(huán)境中待沉淀透亮后滴加無(wú) RNA酶水40 μl，最后獲取物保存于-70 ℃冰箱中備用。

1.2.3互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)樣品合成 吸取1 μg總RNA，使用Iinvitrogen公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA 樣品置于-20 ℃保存，作為下一步RT-PCR的模板。

1.2.4IGF1RAIN RNA分析 實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)量肝癌切除癌瘤組織、瘤旁組織中IGF1RAIN RNA含量，根據(jù)模板或引物配置RT-PCR反應(yīng)的混合液[IGF1RNA反義非編碼RNA上游引物正向序列：5’-CGACACATGGTCCAATCACTGTT-3’；IGF1RAIN RNA下游引物正向序列：5’-AGACTCCCCTAGGACTGCCATCT-3’； GAPDH正向序列：5'-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 序列：5’-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3’]，嚴(yán)格按照RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，采用探針?lè)z測(cè)IGF1RAIN RNA的表達(dá)值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為對(duì)照，相對(duì)表達(dá)量采用比較CT法(2-△△CT)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

IGF1RAIN RNA在肝癌癌旁組織中含量較正常肝組織低(P<0.05)；肝癌瘤體中IGF1RAIN RNA含量較正常肝和癌旁組織均顯著下降(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 IGF1RAIN RNA在肝癌、癌旁及正常肝組織中表達(dá)

IGF1RAIN RNA含量與肝癌者的性別、年齡以及是否有乙型肝炎史無(wú)關(guān)(均P>0.05)，但其和癌瘤的大小、癌瘤分化程度及國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control, UICC)肝癌分期有關(guān)(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 IGF1RAIN RNA在肝癌中含量分層比較

3 討 論

正常人組織中也存在癌瘤細(xì)胞，只是這些癌瘤細(xì)胞都處于靜默的G0期，只有這些靜默的癌瘤細(xì)胞啟動(dòng)進(jìn)入G1期才能使發(fā)生癌瘤的細(xì)胞呈幾何級(jí)增殖[6]。研究證實(shí)IGF1RAIN RNA在CD90+細(xì)胞肝癌干細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)肝癌增殖的作用[7-10]。我們前期通過(guò)RT-PCR法、Western-blot法檢測(cè)了5例肝癌組織中CD45-CD90+細(xì)胞內(nèi)IGF1RAIN RNA，結(jié)果顯示其表達(dá)明顯低于正常肝組織，這一結(jié)果提示IGF1RAIN RNA可能參與抑制CD90+肝癌的增殖，這和IGF1RAIN RNA在其他組織來(lái)源的惡性腫瘤中表達(dá)降低的特點(diǎn)相一致的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌患者樣本中，IGF1RAIN RNA的含量和乳腺癌的增生及分期相關(guān)，IGF1RAIN RNA在內(nèi)癌中含量較高，在進(jìn)展期或者轉(zhuǎn)移癌中含量則較低[12]。研究發(fā)現(xiàn)，IGF1RAIN RNA在白血病細(xì)胞系和高風(fēng)險(xiǎn)AML患者的血液中表達(dá)下調(diào)[13]。IGF1RAIN RNA可能在癌瘤中扮演著負(fù)向阻礙機(jī)制，其高表達(dá)時(shí)可以阻礙癌瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移[14]。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌患者的癌瘤中含量更低，分期及分化這兩項(xiàng)條件相同的情況下，IGF1RAIN RNA隨著癌瘤體積增大數(shù)值更低，而與患者年齡是否大于60歲，是否為男性，是否患有乙型肝炎沒(méi)有關(guān)系，這說(shuō)明IGF1RAIN RNA含量可能只和肝癌的本身惡性力有關(guān)。

IGF1RAIN RNA含量降低使得肝癌更容易發(fā)生，IGF1RAIN RNA含量正常可抑制肝癌的發(fā)展，另外，IGF1RAIN RNA含量降低失去了對(duì)肝癌侵襲力、浸潤(rùn)能力的阻礙作用，IGF1RAIN RNA可抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化，也可能抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，其可能成為肝癌的早期診斷指標(biāo)之一[15]。

IGF1RAIN RNA促肝癌的機(jī)制探索還處于起步階段，更多的IGF1RAIN RNA在肝癌中的作用機(jī)制還需要深入研究，已有的研究證實(shí)IGFIR在癌瘤自分泌的信號(hào)傳遞中是一種重要的物質(zhì)，肝癌的惡性程度及分期與IGF1RAIN RNA含量呈負(fù)相關(guān)，這對(duì)肝癌診斷及預(yù)后判斷可能存在臨床價(jià)值，IGFIR信號(hào)傳遞受阻后肝癌的發(fā)展及增殖同樣出現(xiàn)了遲滯，這可能為肝癌治療帶來(lái)新的發(fā)現(xiàn)[16]。IGF1RAIN RNA在肝癌組織中含量較非肝癌組織低，其正常含量下可以抑制肝癌的發(fā)展及增殖，在分化程度及腫瘤分期的統(tǒng)計(jì)中，IGF1RAIN RNA與分化程度呈負(fù)相關(guān)，與分期呈正相關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚。IGF1RAIN RNA是否可以成為抑癌基因家族中的一員還需要繼續(xù)研究，其也可能是靶向抑制肝癌進(jìn)展的一種新分子。