釓塞酸二鈉增強MRI肝膽期全肝直方圖分析評估兔肝纖維化的研究

李宇峰，劉海峰，王晴，杜亞楠，朱祖輝，邢偉

作者單位：蘇州大學第三附屬醫院影像科，常州 213003

肝纖維化(liver fibrosis，LF)是膠原、糖蛋白和蛋白多糖等肝細胞外基質過度沉積的慢性損傷性病理過程，是慢性肝炎、代謝性等慢性肝病向肝硬化甚至肝癌進展的關鍵環節及影響肝病預后的重要因素[1-2]。既往研究表明，未經治療的LF會增加肝硬化、肝細胞癌或肝衰竭的風險，而LF 早期診斷并及時采取的有效的抗纖維化藥物治療，可逆轉早期LF，肝移植是目前唯一有效治療晚期LF 及肝硬化的方法[3-4]，因此了解LF 精準診斷及分期對指導治療、患者預后判斷具有重要的臨床價值。

肝活檢一直被認為是診斷LF 的參考標準，但其作為一種有創方法，存在許多并發癥及局限性[5]。肝功能Child-Puph分級雖然廣泛應用于臨床肝功能評估，但其5 項指標對于評估肝實質病變敏感性不高，且容易受治療因素影響。釓塞酸二鈉(gadolinium ethoxybenzyl diethylenetriamine pentaacetic acid，Gd-EOB-DTPA)作為一種新型肝細胞特異性對比劑，前期研究證實Gd-EOB-DTPA 增強MRI 肝膽期信號強度評價對LF診斷及分期具有較高的價值[5-6]。Hako等[6]研究表明Gd-EOB-DTPA MRI 是評估LF 最準確的無創方法。Noren 等[7]研究結果顯示LF分期顯著影響著肝細胞對Gd-EOB-DTPA的特異性攝取。

直方圖作為一種新的肝紋理分析方法，可以采用數學模型分析肉眼看不到的圖像灰度信息，準確、定量評估肝臟異質性隨LF 進展的變化[8]，既往研究表明，MR 直方圖分析有助于LF 的檢測和分期，不同功能的MRI 序列[包括彌散加權成像(diffusion weighted imaging)、敏感性加權成像(sensitivity weighted imaging)和磁共振彈性成像(magnetic resonance elastography)]的直方圖分析對反映組織病理學異質性和診斷LF分期有很大的臨床價值和意義[9]。但目前尚未見基于Gd-EOB-DTPA 增強MRI 肝膽期的直方圖分析鑒別診斷LF 的研究。因此，本研究擬探索Gd-EOB-DTPA 增強肝膽期直方圖分析成像對診斷LF 的價值，為LF 診斷及治療提供客觀的影像學依據。

1 材料與方法

1.1 動物模型

本研究經過本單位醫學倫理委員會批準[批準文號：(2018)科第025 號]前瞻性納入100 只健康新西蘭雌性大白兔(6 月齡，體質量2.0～2.6 kg)，單籠飼養(溫度20 ℃～28 ℃，濕度40%～70%)，隨機分為LF 組(80 只)和正常對照組(20 只)。LF 組[10]頸背部皮下注射50%四氯化碳油(CC14)溶液(100%CC14與橄欖油1∶1 均勻混合)，第1～3 周劑量0.1 mL/kg，第4～6 周劑量0.2 mL/kg，第7～10 周劑量0.3 mL/kg，每周注射1～2次，對照組兔僅注射同劑量、等頻率的生理鹽水。

1.2 Gd-EOB-DTPA增強MRI肝膽期成像

在注射50%CC14溶液的第4、5、6、15 周末隨機選擇20 只LF 兔和5 只正常對照兔進行Gd-EOB-DTPA增強MRI 肝膽期成像。掃描前兔禁食12 h，肌注水合氯醛0.1 mL/kg，并在掃描過程中采用小動物麻醉儀(ABS-100，Y100141035，China)保 持 面罩吸入3.5%異氟烷維持麻醉。MRI 掃描采用3.0 T 超導MRI 掃 描儀(Philips Achieva，Philips Medical Systems，Best，the Netherlands)，18 通道相控陣頭頸線圈，保持兔仰臥位并用腹帶固定腹部抑制呼吸。掃描序列包括：(1)軸位T1WI：重復時間(TR)185 ms，回波時間(TE) 185/3.3 ms，翻轉角(FA)=15°，掃描野(FOV) 160 mm×140 mm，層厚(ST) 4 mm，層間距(SP) 0.4 mm；(2)軸位Gd-EOB-DTPA 增強MRI肝膽期成像：采用多梯度回波序列，TR 1090 ms，TE 3.4～39.2 ms，翻轉角15°，層厚4 mm，層間距0.4 mm，矩陣218×256。

1.3 圖像分析

Gd-EOB-DTPA 增強MRI 肝膽期圖像以DICOM 格式存儲，并傳輸到Firevoxel 軟件(FireVoxel，329；https：//wp. nyu. edu/firevoxel/downloads/)，由2 名分別具有5 年和10 年以腹部影像學為研究方向的放射醫師在雙盲前提下對獲取的MR圖像分別獨立進行直方圖分析，如遇分歧則通過討論解決。逐層手工勾畫ROI以覆蓋全肝，避免肉眼可見血管、膽管、偽影和肝邊緣(圖1)，獲取全肝肝膽期直方圖及以下參數值：平均值(mean)，中位數(median)，不均質性(inhomogeneity)，偏度(skewness)，峰度(kurtosis)，熵值(entropy)，第10 (10th)、25 (25th)、75 (75th)和90(90th)百分位數。

圖1 Gd-EOB-DTPA 肝膽期全肝直方圖分析感興趣區勾畫示意圖 圖2 肝纖維化1 期和3 期在典型病理特征、肝膽期偽彩圖及直方圖的對比F1 期兔病理圖(A)、偽彩圖(B)、直方圖(C)，F3 期兔病理圖(D)、偽彩圖(E)、直方圖(F)Fig. 1 Delineation of ROI in Gd-EOB-DTPA hepatobiliary phase histogram analysis. Fig. 2 Pathological picture of F1 rabbits(A),artificial colour map(B),histogram(C),pathological map of F3 rabbit(D),artificial colour map(E),histogram(F).

1.4 病理學檢查

Gd-EOB-DTPA增強MRI肝膽期掃描完成后空氣栓塞致死實驗兔，取兔肝臟并置于10%福爾馬林溶液浸泡，甲醛固定后制石蠟切片，行Masson 染色后2 名富有經驗的病理醫師于顯微鏡下進行Metavir 分期：F0：無LF；F1：門靜脈匯管區擴大，局限竇周、小葉內纖維化；F2：匯管區周圍纖維化或少量間隔形成，小葉結構保留；F3：大量纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；F4：肝硬化。其中F1～F2 期為早期LF，F3～F4期為晚期LF。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0 和MedCalc 18.2 軟件進行統計學分析。采用Spearman 相關性分析直方圖各定量參數值與LF 進展的相關性，以P＜0.05 為差異有統計學意義，并以相關系數r值的絕對值大小表示相關性高低，|r|＞0.7、|r|=0.4～0.7、|r|=0.2～＜0.4 分別代表強、中等、弱相關，|r|＜0.2 代表無相關性。對于與LF 進展呈現明顯相關性的參數值，采用Mann-WhitneyU檢驗比較各正常對照組、早期LF (F1～F2)、晚期LF 組(F3～F4)之間定量參數值的差異性，并應用AUC 值分析各定量參數值鑒別診斷F0 與F1～F4、F0 與F1～F2、F1～F2 與F3～F4、F0 與F3～F4 的效能。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔LF模型和病理學結果

初步納入研究的100 只實驗兔中，6 只LF 兔因不耐受CC14死亡，1 只正常兔和3 只LF 兔因麻醉意外死亡而未納入，1 只正常對照組和5 只LF 兔因呼吸、運動偽影重導致Gd-EOB-DTPA 增強MRI 肝膽期圖像質量較差而排除，故最終納入18 只正常對照組兔和66 只LF 兔。F0 期18 只，F1 期17 只，F2 期17 只，F3 期18 只，F4 期14 只，早期LF (F1～F2)兔34 只，晚期LF(F3～F4)兔32 只。LF 典型病理特征、肝膽期偽彩圖及直方圖如圖2所示。

F1 期LF 病理圖，門靜脈匯管區擴大，局限竇周、小葉內纖維化(2A)；F3 期LF，大量纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化（2D；Masson 染色 ×100）；F1～F3 期，肝膽期偽彩圖Map 信號減低(2B、2E)；F1 期(2C)和F3 期(2F)直方圖，F1～F3 期直方圖向左偏移，參數值增大。

2.2 直方圖參數值與LF進展相關性分析

LF 各期的全肝肝膽期圖像直方圖參數值的分布如表1所示。隨著LF進展，不均質性(r=0.809)和90th參數值(r=0.718)呈強正相關性(P＜0.001)，75th(r=0.645)、熵值(r=0.546)、中位數(r=0.425)中等正相關性(P＜0.05)，峰度呈弱相關(r=0.305，P＜0.05)，而平均值、偏度、10th、25th、50th與LF進展未見明顯相關性，具體如表2所示。

表1 肝纖維化不同分期直方圖參數值(±s)Tab.1 Histogram parameter values of different LF stages(±s)

表1 肝纖維化不同分期直方圖參數值(±s)Tab.1 Histogram parameter values of different LF stages(±s)

參數值對照組(F0，18例)肝纖維化組(F1-F4，66例)F1 (17例)F2 (17例)F3 (18例)F4 (14例)早期肝纖維化(F1-F2，34例)晚期肝纖維化(F3-F4，32例)F值P值平均值1120.76±213.50 1084.57±244.69 1049.20±215.65 1166.31±247.14 1047.00±274.84 1076.54±236.17 1107.76±235.99 1059.93±255.02 0.788 0.537中位數1053.00±115.87 1148.35±143.07 1099.91±63.92 1131.40±194.93 1169.80±171.40 1200.14±71.82 1115.66±143.73 1183.08±136.05 2.949 0.025偏度-0.84±0.31-0.64±0.54-0.52±0.60-0.70±0.49-0.54±0.58-0.85±0.44-0.61±0.54-0.77±0.54 1.706 0.157峰度2.20±0.73 2.54±0.80 2.28±1.05 2.46±0.70 2.61±0.52 2.88±0.80 2.37±0.89 2.73±0.76 1.945 0.111熵值3.40±0.20 3.60±0.18 3.49±0.18 3.57±0.15 3.64±0.17 3.72±0.15 3.53±0.17 3.68±0.16 8.961＜0.001不均質性0.21±0.33 0.27±0.47 0.22±0.03 0.25±0.03 0.28±0.02 0.33±0.02 0.24±0.03 0.30±0.03 40.240＜0.001 10th 812.05±162.70 829.39±194.16 805.89±185.04 870.71±212.28 801.68±209.76 843.36±170.65 838.30±198.83 819.91±191.86 0.411 0.800 25th 999.00±193.65 980.79±221.40 946.89±205.13 1040.59±226.30 946.57±253.32 993.32±195.87 993.74±217.94 967.03±227.67 0.575 0.682 75th 1046.01±100.85 1159.47±101.73 1088.73±108.54 1125.39±86.76 1190.20±68.30 1247.24±64.89 1107.06±98.53 1215.16±98.53 13.200＜0.001 90th 1161.13±85.79 1314.49±115.95 1223.77±95.43 1282.17±85.55 1355.00±96.07 1413.95±99.41 1252.97±94.03 1380.79±100.44 19.370＜0.001

表2 直方圖參數值與兔肝纖維化進展的相關性Tab.2 Correlation between histogram parameter values and LF progression

2.3 不同LF分期直方圖參數值比較

如圖3 所示，中位數無法有效鑒別診斷，F0 與F1～F4、F1～F2 與F3～F4、F0 與F3～F4 期比較，峰度值差異不顯著。熵值、不均質性、75th、90th可有效鑒別診斷正常、早期和晚期LF。

圖3 中位數(A)、峰度(B)、熵值(C)、不均質性(D)、75th(E)、90th(F)與兔肝纖維化進展箱式圖Fig. 3 Median (A), kurtosis (B), entropy (C), heterogeneity (D), 75th (E), 90th(F)and LF progress box chart.

2.4 ROC診斷效能

參數值不均質性鑒別診斷F0 與F1～F4、F0 與F1～F2、F0與F3～F4、F1～F2與F3～F4的AUC值分別為0.87、0.77、0.90、0.97，高 于90th(AUC=0.86，0.76，0.83，0.97) 和75th(AUC=0.79、0.66、0.87、0.92)，熵值(AUC=0.77、0.66、0.74、0.88)和中位數(AUC=0.69、0.59、0.71、0.80)診斷價值較低，而峰度值(AUC=0.63、0.57、0.63、0.71)診斷價值最低(表3；圖4)。

圖4 F0與F1～F4(A)，F0與F1～F2(B)，F1～F2與F3～F4(C)，F0與F3～F4(D)分期的ROC曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of F1～F4(A)，F0與F1～F2(B)，F1～F2與F3～F4(C)，F0與F3～F4(D).

表3 直方圖參數值診斷肝纖維化分期的ROC曲線分析Tab.3 ROC curve analysis of histogram parameter value in diagnosis of LF staging

3 討論

3.1 實驗背景

Gd-EOB-DTPA 能通過肝細胞膜有機陰離子轉運多肽(organic anion transport polypeptide，OATP)轉運吸收，LF 進展引起肝功能受損，OATP 減少，加之LF 進展伴隨的細胞外基質沉積增多引起Gd-EOB-DTPA 攝取進入肝細胞內速度減慢、單位時間內進入肝細胞的量減少，導致攝取Gd-EOB-DTPA 減少，因此肝膽期信號隨LF 進展降低[9-12]。本研究為肝膽期成像鑒別診斷LF 提供理論基礎。Hako 等[6]和Noren等[7]學者研究證實肝膽期肝臟信號強度鑒別診斷早期(F1～F2)、晚期(F3～F4) LF 的敏感度和特異度分別為96.30%、90.62%，但目前未見基于肝膽期直方圖分析評價LF的研究。

3.2 直方圖分析的優勢

直方圖分析是紋理分析的一種方法，其利用數學方法對獲得的圖像數據的ROI灰度分布進行評價，量化病理變化的異質性，反映早期病理階段肉眼無法檢測到的細微變化，其突破了局限于大小、密度和形態學等傳統影像學征象觀察，能通過提取醫學圖像中的直方圖參數值，對圖像灰度值(像素)變化規律和分布模式進行深度挖掘、量化分析[13-16]。前期基于體素內不相干運動[9]和擴散峰度成像[13]的直方圖分析可有效鑒別LF病理分期及分析圖像灰度變化，為功能成像MR無創預測LF進展及診斷提供了新的研究思路。研究表明，LF 與活化的肝星狀細胞密切有關，肝星狀細胞在LF 過程中的形態、超微結構、基因表達和細胞功能均發生明顯改變，顯示其異質性。因此，直方圖分析對LF的診斷和分期具有潛在價值。

3.3 MRI 肝膽期全肝直方圖各參數值結果以及原因分析

本研究基于實驗兔肝膽期全肝直方圖分析的研究顯示參數值不均質性可有效預測LF，而且診斷LF各期的效能較高，與Yang 等[17]學者的研究結果相符。隨著LF進展，細胞外基質沉積、過度鐵沉積及炎性水腫增加，肝血竇內皮細胞破壞，這一系列病理變化導致灰度異質性隨LF進展增大呈正相關。本研究結果顯示中位數鑒別診斷LF 的價值較平均值高，這可能是由于平均值受肝臟邊緣及噪聲所引起的異常信號強度值影響[15]。參數值90th代表小于第90%體素區間內的平均灰度值，其與LF 進展相關性較90th更高、鑒別診斷價值較大，而較小的10th較25th診斷價值較低，提示較高的百分位數參數值更適用于反映HF 病理特征，與Barry等[18]和Zheng等[19]的研究結果相符。

偏度值代表總體灰度值直方圖分布的對稱性，偏斜程度越高代表偏度值越大。偏度值鑒別診斷各期LF 的效能較低，表明隨著LF 進展直方圖偏斜程度變化較小，本研究結果與Sheng 等[16]研究結果相符，Wang等[20]研究結果顯示，MR的T1圖的直方圖分析，特別是20 min 肝結合蛋白-T1 的熵，有助于預測LF 分期。峰度值反映直方圖分布形態陡緩程度，數值越大表示其分布的陡緩程度與正態分布差異越大。我們的研究發現峰度值隨LF 進展呈增加趨勢，與Yoon等[21]學者相符，表明隨著LF 進展直方圖灰度值陡緩程度增加，峰度值可作為有效預測LF 進展的影像學參數值。熵值代表全肝直方圖參數值分布的復雜程度，熵值越大，則直方圖分布越分散。在本研究中，熵值增加可反映LF 進展，與Fujimoto 等[22]和Xu 等[23]的研究結果一致，Fujimoto 等[22]發現熵值隨著纖維化程度的增加而增加。

通過直方圖分析參數值提取的量化參數雖然不能代表真正的病理狀態，在本研究中，在整個肝臟的每一個軸位層面上描繪了感興趣區，其所獲得的定量參數反映整個肝組織纖維化的整體特征，所得到的參數值受主觀因素影響較少，在一定程度上反映LF內在異質性，具有無創性、重復性高的優勢。

3.4 不足與展望

但本研究也存在一定的局限性：(1)雖然本研究基于肝臟最大層面勾畫全肝直方圖感興趣區，但本研究僅分析肝臟最大層面的直方圖分析特征，未能分析全肝三維特征。(2) CCl4誘導的兔模型無法準確反映人類肝臟組織的病理學變化，因此，高質量、前瞻性臨床探究成為未來科研的方向。(3)多模態影像學對LF 分級有一定研究，對F1 級、F4 級能夠明確區分，但對于F1、F2級之間則區分困難，因此，尋找一種能有效反映LF 細微變化的圖像紋理分析，仍是今后研究探索的方向。

總之，基于Gd-EOB-DTPA 增強MRI 肝膽期的直方圖參數值分析對預測實驗兔LF 進展、分期和評價肝臟灰度異質性具有較高的診斷及鑒別診斷價值，有望成為無創評估LF的影像學方法。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。