體素內不相干運動成像及微血管密度與宮頸癌病理分級的相關性研究

冉儀婷，卑貴光

作者單位：1.中國醫科大學中國人民解放軍北部戰區總醫院放射診斷科，沈陽，110812；2.電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院 成都市婦女兒童中心醫院放射科，成都 610091；3.中國人民解放軍北部戰區總醫院放射診斷科，沈陽 110812

宮頸癌是女性生殖系統中常見的惡性腫瘤，近年來，發生率日益攀升，現已位于女性中所有惡性腫瘤中診斷率及死亡率第四位[1]。宮頸癌的病理分級對治療方案及預后有提示作用。磁共振擴散加權成像(diffusion-weighted imaging，DWI)作為一種具有無創優勢的功能成像技術，尤其是DWI衍生技術體素內不相干運動成像(intravoxel incoherent motion，IVIM)依靠雙指數模型技術能將組織內的擴散運動及灌注運動區分開，從而更加準確地反映腫瘤微環境狀態的改變。現今，有研究證明IVIM 各參數在評價宮頸癌分化程度、病理類型方面也表現出差異及可鑒別性[2-4]，但各IVIM參數與宮頸癌病理分化程度間的關系說法尚不一致。宮頸癌的病理級別影響臨床的治療方案，筆者探討IVIM 各參數與宮頸癌病理級別的相關性，可以為臨床診療提供參考。

微血管密度(microvesssel density，MVD)可以反映腫瘤組織內血管分布，是腫瘤生長、發展的基礎，且與腫瘤生物學特征有一定相關性，能夠提供腫瘤的血供特點和細胞活性信息，從而判斷腫瘤的進展情況。腫瘤的分化程度降低，惡性程度明顯增大，浸潤能力也會進一步增強。大量研究證實腫瘤微血管的增多及血管內各血管生成因子的增加，有利于腫瘤細胞的增殖加速，腫瘤更容易發生浸潤及轉移。目前，在泌尿系腫瘤及腦膠質瘤等研究中表明[5-7]，血管生成與腫瘤的分級明顯相關，MVD隨腫瘤分化級別的增高也明顯增加。因此，通過評估MVD可以預測宮頸癌的病理分化程度，本研究將進一步論證，MVD反映的腫瘤灌注方面的信息，以及MVD與IVIM參數之間的聯系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性研究中國醫科大學北部戰區總醫院2016年6月至2019 年7 月收治的26 例宮頸癌患者，年齡37～70 (52.9±7.93)歲；低分化患者8 例，高分化患者本6 例，中等分化患者12例；納入標準：(1)進行手術并經病理證實分化程度；(2)在我院存檔手術蠟塊；(3)臨床分期＞IA1 期；(4)影像科數據站存有手術前多b 值序列數據的患者。排除標準：(1)磁共振檢查前接受過放化療；(2)圖像質量欠佳。本研究經過中國人民解放軍北部戰區總醫院醫學倫理委員會批準(批準文號：BL201713)，免除受試者知情同意。

1.2 儀器與檢查方法

MRI檢查采用GE Discovery MR750 3.0 T磁共振機進行常規掃描，所有患者取仰臥位，腹部8通道相控線圈。掃描參數：(1)橫斷面T2WI：fs-FRFSE，TR 3896 ms，TE 71.7 ms，視野(FOV)300 mm×225 mm；(2)矢狀面T2WI：fs-FSE，TR 3516 ms，TE 69 ms，FOV 215 mm×270 mm；(3)橫斷面T1WI：FSE，TR 637 ms，TE 9.1 ms，FOV 280 mm×210 mm；(4)冠狀面T2WI：WATER IDEAL，TR 1997 ms，TE 68.6 ms，FOV 280 mm×210 mm，以上序列層厚5 mm，層間距6 mm；(5)矢狀面IVIM DWI 技術掃描：頻率FOV 28，相位FOV 0.35～0.50，減小矩陣，改變頻率編碼方向，1 次掃描11 個b 值(0、30、50、100、150、200、300、500、800、1200、1500 s/mm2)。病理分級由2名高級別病理醫生閱片，評估宮頸癌病灶分化程度，根據宮頸癌的組織學分級Borders修訂版分級法，分級系統由細胞異型性、核分裂和角化珠的數量組成，分為低度惡性的高分化宮頸癌、中度惡性的中分化宮頸癌、高度惡性的低分化宮頸癌；病理學免疫染色取術后病變組織，采用甲醛固定，石蠟包埋，行病理切片。用CD34 染色劑染色，采用SP法測定MVD，試劑盒由北京中杉生物技術有限公司生產。

1.3 圖像分析

IVIM 圖像應用GE AW4.5 Functool MADC 軟件，利用工作站軟件測量感興趣區ADC 值，感興趣區為類圓形，取宮頸癌組織最大截面處，在病灶邊緣勾畫ROI 值，應避免囊變、出血、壞死區，部分較大病灶多點測量，通過雙指數模型取得IVIM 各參數：慢速表觀擴散系數(D)、快速表觀擴散系數(D*)，以及灌注分數(f)。病理圖像：于光鏡低倍鏡(×20)物鏡下選擇腫瘤組織內MVD 密集處，再于高倍物鏡(×40)下對MVD 進行測定，具體方法按照Weidner 等[8]的方法。每個標本計數5 個視野，取其平均數，MVD值=(n1+n2+n3+n4+n5)/5。由2名同級別醫生分別對病灶進行二次勾畫，并對各參數結果進行組間一致性差異檢驗，檢查結果ICC在0.87～0.96。

1.4 統計學分析

使用SPSS 25.0統計學軟件包，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷不同分化程度患者的IVIM各參數值是否符合正態分布，若符合，采用ANOVA檢驗對比各組均值；若不符合正態分布，則采用非參數檢驗Kruskal-WallisH檢驗；P＜0.05 表示差異有統計學意義；不同分化組中IVIM各參數與MVD之間的相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 子宮頸癌不同病理分級MRI參數比較

分析宮頸癌不同病理分級組(高分化：G1；中分化：G2；低分化：G3)與IVIM各參數(D、D*及f值)結果如表1、2及圖1～3所示。非參數秩和完全隨機設計多個樣本比較的Kruskal-WallisH檢驗結果(表1)示D值、D*值在三組間差異有統計學意義，f值三組間差異無統計學意義；D值隨分化級別增高數值減低(即低分化組D值中位數值最低)；D*值中位數隨分化級別增高數值逐漸減低。兩兩組間比較(表2)示D值在三組組間比較差異均有統計學意義，低分化組D*值低于高分化、中分化組，D*值在低分化與高分化組、低分化與中分化組組間比較差異有統計學意義，高分化組與中分化組組間比較差異無統計學意義。

圖1 宮頸癌IVIM D 值在各分化組中分布箱式圖

表1 宮頸癌不同病理分級與IVIM各參數比較

2.2 宮頸癌各分化組之間微血管密度比較

分析宮頸癌不同分化組(G1、G2、G3)與MVD 結果如表2 和圖4所示，MVD在不同分化組組間比較，差異皆具有統計學意義。

圖4 比較宮頸癌各分化組MVD 分布箱式圖

表2 三組組間兩兩比較各IVIM各參數及微血管密度

2.3 IVIM各參數及MVD之間及與病理分級的相關性分析

經一元線性回歸方程檢驗，IVIM 各參數與MVD 進行相關分析，D*值與MVD 相關性有統計學意義，P＜0.05；再由方差分析對包含常數項的回歸方程做顯著性檢驗，F=10.6，P＜0.05，差異有統計學意義，回歸方程有意義(圖5)。直線方程為y (D*)=0.092-0.002×MVD，決定系數r2=-0.554。D*值與MVD成中度負相關(r2為0.41～0.70 表示中度相關)。其他IVIM參數(D 值、f)與MVD 相關性分析不具有統計學意義。G1、G2 及G3 各組中示例的IVIM 各參數（D、D*及f 值）、MVD 值如圖6～8所示。

圖5 宮頸癌IVIM D* (ADCfast)值與MVD 的Pearson相關分析

圖6 女，70歲，高分化宮頸癌。A：DWI與腫瘤的雙指數分析，在腫瘤邊緣繪制ROI；B：在D參數圖上，D值為2.17×10-3 s/mm2；C：在D*參數圖上，D值是2.3×10-2 s/mm2；D：腫瘤標本的CD34染色(×400)顯示約17個不成熟的腫瘤微血管 圖7 女，59歲，中分化宮頸癌。A：腫瘤雙指數分析的DWI圖像；B：在D 參數圖上，D 值為0.82×10-3 s/mm2；C：在D*參數圖上，D*值為0.91×10-2 s/mm2；D：腫瘤標本的CD34 染色(×400)顯示約27 個未成熟的腫瘤微血管 圖8 女，57 歲，低分化宮頸癌。A：腫瘤雙指數分析的DWI；B：在D 參數圖上，D 值為0.12×10-3 s/mm2；C：在D*參數圖上，D*值為0.62×10-2 s/mm2；D：腫瘤標本的CD34染色(×400)顯示約31個不成熟的腫瘤微血管

3 討論

3.1 IVIM各參數的基本原理、與病理分級的相關性探討

目前婦科病理學者主要依據細胞形態將其分為G1、G2、G3級，G1級即高分化型，核分裂不多，惡性程度低；G2、G3級分別稱中、低分化型，核分裂和細胞異型明顯，惡性程度高。中高分化腫瘤的預后優于低分化腫瘤，但目前病理分級依靠活檢，屬于有創檢查。因此磁共振成像作為無創檢查，判斷宮頸癌病理分級至關重要。常規磁共振技術尚不能滿足腫瘤病理分化分類的需要，IVIM作為新發展領域，有望解決術前腫瘤病理分級難題。IVIM 作為DWI 技術的延伸，通過水分子的微觀運動及局部的灌注改變來評估腫瘤組織的擴散和灌注特點，可定量測定解析多個模型參數值，真擴散系數D 值，理論上能去除微循環快速血流影響，更準確地反映水分子擴散。D*代表與血流灌注相關的快擴散系數，f 代表灌注分數，可探測到的水占毛細血管網的體積比[9]。

圖2 宮頸癌IVIM D*值在各分化組中分布箱式圖

圖3 宮頸癌IVIM f 值在各分化組中對比箱式圖

有研究表明，IVIM 參數與各種腫瘤的病理分級相關[10]。其中，D*值表示除細胞間水分子運動以外的灌注信息，即病灶內血管灌注占較大灌注比例，同時還包括其他脈管系統的灌注情況(例如乳腺導管、唾液腺及胰管等)[11]。本實驗結果表明，D*值隨腫瘤分級的增高而降低，從病理學角度講，隨腫瘤的分級增高，惡性程度增高，血流灌注也會相應增高[12]，這與本實驗結果相反。目前，部分研究中關于D*值與病理分級之間的關系的結論也存在分歧，相世峰等[3]和Zhou等[4]研究結果顯示D*值與病理分級之間的差異不具有統計學意義，Du 等[13]研究表明D*值隨腫瘤分級增加而增高。Federau 等[14]在腦膠質瘤IVIM灌注參數值的研究中顯示D*值與膠質瘤的病理分級無意義，這可能與腫瘤內大量新生血管生成，微血管網絡結構改變有關系，此學者亦指出灌注參數(D*值、f值)與多種因素相關，例如血流壓力、血流速度等。李乃玉等[15]提出，D*值隨病理分級增加逐漸減小，可能是由于低分化病灶中微血管存在癌栓，本研究中低分化患者的病理結果亦表明大多數病灶中微血管存在癌栓，也支持這種觀點。當然，這種理論目前需要大量研究繼續探究驗證。

D值反映細胞內外水分子的擴散，在不同分級的宮頸癌病理表現中，分級增高，分化程度越低，細胞核分化不成熟，核漿比增大，低分化型(G3 級)細胞異形性明顯，體積增大，因此在顯微鏡下細胞顯示密集，細胞外間隙減少。真擴散系數D 值反映細胞外水分子的運動，其主要影響因素是細胞外間隙及細胞內水分子擴散，分化級別越高，細胞外間隙越小，細胞外水分子活動受限明顯，表現為D 值隨分級增加而減低。本研究中D 值隨病理分級增高而減低，各病理分化組中統計學結果均有意義，提示D 值在不同分化程度的宮頸癌中水分子擴散運動有明顯差異。研究結果與大多數研究一致[3,15]。此外，將D值與MVD之間的關系進行分析，結果顯示兩者無直線相關性，提示IVIM技術中的D值能準確反映微觀擴散運動，而不受局部灌注的影響。

灌注分數f 在區分宮頸癌病理分級方面存在爭議，相世峰等[3]研究結果示f 值在不同宮頸癌病理分級之間的差異無統計學意義；部分學者研究結果則相反[15]。在本研究中，f 值與病理分級之間的差異無統計學意義。且與MVD 值不具有直線相關性。導致研究結果的不一致可能來源于灌注分數容易受到多種因素的影響，例如微血管網的數目、血流速度、血管壁壓力或者IVIM 設定的b 值的不同[11,14]。因此，IVIM 中的灌注分數f在對宮頸癌病理分級的預測方面需要進一步論證。

3.2 微血管生成原理、與病理分級相關性

血管生成(angiogenesis)是指某些情況下，由于血管生成因子的作用，新生毛細血管從已有的血管中生長的過程，是許多實體腫瘤生長和轉移的關鍵[16]。CD34 作為血管標記物，能標記大部分有明顯血管管腔的血管內皮，通過抗體與相應內皮細胞結合，可以直接反映微血管的生成狀況，具有腫瘤血管檢測的重要意義[17]。目前，已有一些研究表明，MVD 與腫瘤的分級、預后有關系(肝癌、腸癌等)[18-20]，并隨腫瘤級別增高，微血管密度值逐漸增多。Liu 等[21]和馮仙明等[22]學者研究表明，用CD34染色的宮頸癌中，病理分級越高，MVD值也增高，兩者成明顯線性正相關，本研究結果與其一致。

3.3 微血管密度與快速表觀擴散系數(D*)的相關性

如上文所述，IVIM 中能代表血流灌注的參數有D*及f 值，假設D*值能夠代表腫瘤內的灌注信息，也就能反映腫瘤內MVD，那么，IVIM 參數D*值就有潛力成為評價腫瘤血管生成方面一個便捷有力的工具。目前，關于IVIM 中代表灌注的參數與腫瘤內MVD 的關系研究較少。Liu 等[21]在宮頸癌病理分級與磁共振擴散成像的ADC 差值相關聯系的研究中提出，宮頸癌的病理分級與ADC差值顯著相關。ADC差值指的是在多b值條件下，高b值(0～3000 s/mm2)與低b值(0～100 s/mm2)間ADC值的差值，在活體組織中，ADC 最大值來源于腫瘤內的微血管網的流動，與IVIM中的D*值意義相似，該研究證實了ADC差值與MVD 顯著相關，與宮頸癌中的病理分級顯著相關。Lee 等[23]在直腸癌的一項研究結果顯示，多b 值雙指數模型能夠將擴散、灌注信息區分開，IVIM 灌注參數與MVD 明顯相關，這與本研究結果一致。另外，在本研究中，D*值四分位分布區間較大，波動較大，其原因可能與腫瘤內微血管密集區分布變化大有關。在顯微鏡下，微血管密集區常位于癌巢周圍，癌巢分布多位于腫瘤浸潤邊緣，分布散在，這與以上猜測符合。本研究中，快速表觀擴散系數(D*)值與MVD 成負相關關系。兩者之間的研究目前報道極少，D*值影響因素較多，變異性較大，因此兩者之間關系仍需要大量研究來進一步論證。

綜上所述，磁共振IVIM 灌注方面參數D*值與MVD 密切相關；在宮頸癌病理分化程度上，D*值能夠區分出低分化腫瘤，D值可以區分三種不同分化程度的腫瘤。IVIM參數在臨床應用上，能夠為術前腫瘤病理分級預測及臨床治療指向提供有力信息，D*可以作為預測宮頸癌腫瘤血管生成的一項潛力指標。本研究尚有一些地方不足：第一，收集患者樣本量不夠大，特別是低分化組的患者，其原因是該病種由于惡性程度高，生長迅速，首診已是晚期的可能性大，手術指征大多不滿足，因此病理庫蠟塊樣本較少。第二，腫瘤異質性會產生數據誤差和偏倚。在腫瘤中有可能分布不同病理分級，而病理診斷是以惡性腫瘤中分級最高的區域決定的。本文采用多興趣區測量求平均值、腫瘤邊緣放置測量意在減少這種誤差。第三，在IVIM工作站測量數值時，本文選擇腫瘤實性部分測量，部分微小壞死及囊變因素會影響IVIM數值的改變。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。