拉曼光譜技術檢測川芎嗪對視網膜色素上皮細胞氧化應激損傷的保護作用

謝婷，陳陽，陳文奕，賴巧玲，曹改改，許云超，黃焱

1.福建醫科大學醫學技術與工程學院眼視光學系，福建福州350004；2.福建醫科大學醫學技術與工程學院醫學檢驗學系，福建福州350004；3.福建師范大學醫學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建福州350004

前言

視網膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium,RPE）細胞是血‐視網膜屏障的重要組成部分，具有參與視循環代謝，不斷吞噬視網膜光感受器外節段，維持視功能和視網膜結構發育等重要作用。RPE 細胞耗氧量高，多不飽和脂肪酸比例高。作為視網膜大量代謝產物跨膜運輸的重要通道，為了使光感受器能順利地將光刺激傳遞給雙極細胞，RPE需持續不斷地將光感受器無法轉化的全反式視黃醇處理、加工為11‐順式視黃醛后再轉運給光感受器，這一過程進一步增加了RPE 細胞內活性氧自由基（Reactive Oxygen Species,ROS）的清除負擔［1］。當RPE 細胞內ROS 生成和清除機制不平衡時，ROS 所誘導的氧化應激損傷將導致RPE 細胞變性，致發光受體死亡，最終造成視力喪失［2］。近年來研究表明，中藥川芎的有效成分川芎嗪具有擴張血管、改善微循環、減少氧自由基損傷、抗氧化等作用［3］，但其對RPE 細胞的保護作用尚不清楚。到目前為止，雖然許多技術已被證實可用于檢測和分析細胞與其環境之間的體外相互作用，例如流式細胞儀技術、四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法、電子顯微鏡技術，但這些傳統技術無法準確描述細胞在自然狀態下與藥物的相互作用與結合位點?；诜菑椥陨⑸涞睦庾V是檢測活細胞的理想光學平臺［4］。它能根據來自蛋白質、核酸、脂類、碳水化合物和無機晶體的特定信號來評估生物樣品的整體分子組成。此外，拉曼光譜作為一種先進的指紋分析工具，可在單細胞水平監測RPE 細胞的氧化損傷，并從分子水平評估抗氧化損傷藥物的保護效果。本課題組先前采用實驗室自建的顯微拉曼系統結合激光光鑷對RPE細胞進行過光譜采集［5］。雖然光鑷所形成的三維光學勢阱能夠無損傷地囚禁和操縱懸浮在液體中的單個活細胞并實現生化動力學過程的實時跟蹤，但該自建系統的光譜分辨率為4～5 個波數，分辨率較低，活體臨床檢測可行性低。故在先前研究的基礎上，本文利用更高分辨率顯微拉曼系統對先前的實驗進行補充，重新采集并分析3組細胞的拉曼光譜，評估川芎嗪對過氧化氫所誘導的RPE 細胞氧化損傷的保護作用，進一步探索川芎嗪抗氧化的作用機制，為相關臨床研究提供重要的理論依據。

1 材料和方法

1.1 細胞培養和處理

人RPE細胞（ARPE‐19）（Jennio Biotech,中國）采用含有10%胎牛血清（Hyclone, GE Lifescience, 美國）、1%青霉素及1%鏈霉素的改良伊格爾培養基（Dulbecco Modified Eagle Medium,DMEM），于37oC、5%CO2保溫箱中培養。取處于對數生長期的細胞接種于9 個直徑9 mm 的培養皿中，并將其分為3 組（每組3 皿），分別為對照（NC）組、氧化應激（OS）組和保護（LP）組。為了建立合理的氧化應激模型，當細胞約50%匯合后，更換培養液，除NC組外，OS組、LP組均添加終濃度為200 μmol/mL 的H2O2，孵育24 h 后LP 組細胞加入200 μmol/mL 的川芎嗪（Sigma‐Aldrich,美國），再培養24 h后用磷酸緩沖鹽（PBS）緩沖液洗滌2 次，以消除培養基影響，最后用胰酶將細胞消化下來以進行后續的實驗。

1.2 細胞活力測定

采用MultiskanGO（Thermo,USA）微板法測定細胞內ROS的含量，選擇5個濃度梯度的細胞懸液作為篩選的最佳濃度，取1 mL每皿消化下來的細胞懸液，利用細胞計數法將細胞密度稀釋至3～5×104/mL 后，吸取100 μL/孔已經稀釋的細胞懸液于96 孔板中培養，每皿3個復孔。孵育24 h后，去培養基，用PBS緩沖液洗滌2 次，最后按體積比10：1 加入新鮮培養基和CCK‐8 試劑（Beyotime Biotech, 中國）。CCK‐8 培養2 h 后，將處理好的細胞樣品置于96 孔板上，在450 nm 波長下測量可間接反映活細胞數量的吸光度和光密度值。

1.3 細胞活性氧測定

2’,7’‐二氯熒光素二乙酸（DCFH‐DA）是一種非極性燃料，在細胞內活性氧和其他氧化物的作用下可轉化為高熒光的2’,7’‐二氯熒光素（DCF）。將每組的RPE 細胞與5μmol/L DCFH‐DA 在37 ℃避光條件下孵育30 min 后，加入PBS 緩沖液2 mL 洗滌2 次后，更換新的DMEM 培養基。最后使用熒光顯微鏡（IX71,Olympus,日本）測量熒光強度。

1.4 拉曼光譜測定及數據處理

本研究采用InVia 微拉曼系統（Renishaw Corporation, England）對目的細胞進行拉曼光譜采集。以20 mW 功率下產生782 nm 波長的多元件高功率二極管作為激勵源，記錄范圍為400～1 800 cm‐1，每個細胞標本掃描累積時間為20 s，分辨率為1 cm‐1。為了保證單細胞的最佳定位，先用20 倍的物鏡對細胞進行聚焦，隨后再小心地切換到50 倍的物鏡。整個掃描過程聚焦到細胞樣品的激發光束直徑約5 μm，小于細胞直徑。為了確保聚焦區域完全覆蓋細胞，在每個細胞的3 個不同點處均采集光譜。實驗中對每個細胞樣品所測得的3 條光譜先進行熒光背景去除，再將其分別取平均，歸一化處理之后用于代表不同組別樣品。

采集結束后采用SPSS statistics 20（IBM Inc.，芝加哥）軟件對3 組RPE 細胞的拉曼光譜進行數據處理。整個過程主要分為以下兩個步驟：首先考慮到重復實驗時微拉曼系統的狀態可能不同，先將所得的光譜根據曲線下面積進行歸一化，以消除系統本身的影響；再將每組細胞的全光譜作為數據源，應用決策樹（Decision Tree, DT）和主成分分析法（Principle Component Analysis,PCA）進行數據分析。本研究所使用的DT 模型是基于SPSS 軟件的分類與回歸樹（Classification and Regression Tree, CART）算法。CART 分析主要包括3 個重要部分：（1）特征選擇。本文采用基尼指數來測定純度指數，基尼系數越低，純度越高。（2）利用二進制拆分過程構建最大樹，盡可能多地描述訓練數據集。（3）樹的修剪。決策樹的過度生長可能會導致過擬合，因此需要對擬合模型進行修剪，并通過交叉驗證來選出最優樹。最終利用PCA進行特征峰的識別［6］。

2 結果與討論

2.1 川芎嗪可逆轉氧化應激所導致的細胞損傷

利用熒光顯微鏡通過測量DCFH‐DA 熒光探針的氧化產物DCF的熒光強度來測定細胞內ROS的累積量（圖1）。如圖1b 所示，OS 組的DCF 產物明顯多于NC 組和LP 組。通過比較LP 組與NC 組光密度值，還發現川芎嗪可抑制氧化應激環境下RPE 細胞ROS 的產生。不僅如此，細胞活性檢測發現OS 組的細胞存活率約為NC 組的（70.7±0.84）%。川芎嗪的干預使得LP 組細胞的存活率上升至NC 組的（83.5±0.31）%。但ROS抑制RPE細胞增殖活性的作用機制以及川芎嗪抗氧化作用位點尚不清楚，需要借助拉曼光譜技術來進一步探索。

圖1 RPE細胞中活性氧自由基水平的示意圖Fig.1 Representative diagrams of reactive oxide species(ROS)levels in retinal pigment epithelium(RPE)cells

2.2 3組細胞平均拉曼光譜的外形比較

本研究共獲得3組細胞拉曼光譜共50例，其中NC組細胞特征光譜15例、OS組特征光譜15例、LP組特征光譜20例。3組細胞拉曼光譜峰位歸屬及分子結構見表1。在400～1 800 cm‐1范圍內可見不同組細胞拉曼光譜呈現多個譜峰，且形態相近。為了更直觀地測定氧化損傷RPE細胞與正常RPE細胞之間的光譜差異，將3組細胞平均光譜進行兩兩對比，最終所獲得差異性光譜顯示，不同組細胞間的拉曼光譜存在一定差異（圖2）。在量化每個光譜波段的強度值變化后，不同的光譜區域呈現出不同的變化趨勢。例如，H2O2干預后，750～1 000 cm‐1和1 325～1 410 cm‐1區域的峰值強度呈負向變化趨勢，而1 000～1 140 cm‐1和1 430～1 490 cm‐1區域的峰值強度則呈正向變化趨勢（圖2b）。

圖2 歸一化的平均拉曼光譜和差異光譜Fig.2 Normalized mean Raman spectra and difference spectra

2.3 RPE細胞拉曼光譜的多元統計學分析

應用PCA對所獲得的拉曼光譜數據進行PCA變換，發現前9 個主成分可表達98%的原始信息，且由于主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的特征方差貢獻率最大，最終選擇用前兩個主成分的載荷圖及得分散點圖來代表原始數據的光譜信息（圖3）。圖3a 和3b 所示的PC1 和PC2 載荷圖，包含了用于計算類別區分的頻譜特征信息。圖3e 為3 組細胞拉曼光譜主成分分析后得到的聚類散點圖。雖然不同組與其他組均存在部分重疊，但仍可明確不同組之間確已存在分離趨勢（如圖中箭頭所示）。不僅如此，圖3c 和圖3d 中PC1 及PC2 的得分箱式圖也證實了OS 組、NC 組和LP 組之間的差異性，OS 組PC1 與PC2 得分值與NC 組及LP 組相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。每張拉曼光譜1 492 個數據點中可提取出57個主成分，將不同組提取出的主成分通過兩兩比較來建立決策樹模型，并采用交叉驗證方法對鑒別模型進行檢驗。基于CRT 算法的決策樹模型的原理是通過確定一系列if‐then 邏輯關系，形成一組層次規則，用樹圖表示所有可能結果的概率分布，從而達到對研究對象進行準確預測或正確分類的目的［7］。在交叉驗證過程中，所構建的決策樹能量化每條光譜譜帶的重要性，以確定每個模型中最重要的預測因子。表2總結了各鑒別模型的準確率，結果顯示每個模型的分類準確率都在90%以上，甚至有一半以上模型的分類準確率達到100%，表明此鑒別模型預測能力良好，即使是輕微的光譜差異都能被正確分類。

表2 3組細胞分類模型的混淆矩陣Tab.2 Confusion matrix for the classification model of 3 groups of RPE cells

圖3 前兩個主成分的得分圖Fig.3 Score plots of the first two principal components

基于峰位歸屬的相似性、化學鍵（振動模式的差異）或生物功能，對同一類別的譜帶進行配對。最終根據不同組細胞間譜帶強度的變化及其所屬的基團和化學鍵，來進一步探索視網膜氧化應激潛在的生物標志物。拉曼光譜的峰強度比作為一種有效的方法已應用于許多生物樣品拉曼光譜數據的分析中［8］。首先將OS 組和LP 組全拉曼光譜的峰強度值分別與NC 組相比，再從所得到的比值中挑選出幾條相對強度差異最突出的譜帶（圖4）。

圖4 拉曼光譜的峰強度比值Fig.4 Peak intensity ratios of Raman spectra

對比OS 組與NC 組，發現雖然兩組之間的拉曼光譜顯著差異在DNA、蛋白質和脂質類型的分子中都有涉及，但主要集中在蛋白質分子上。視網膜氧化應激生物標志物及年齡相關性黃斑變性代謝組學特征的相關研究表明［9‐10］，脂質和氨基酸含量和結構的變化確實與氧化應激所引起的眼底病變密切相關。結合圖4證明氧化應激位點主要位于某些氨基酸和脂類中。有證據表明，ROS 在細胞生長、分化、凋亡、基因表達等重要信號通路中起重要作用［11］。

過氧化氫所誘導產生的RPE 細胞的抗氧化防御機制失代償主要表現在氨基酸譜帶峰強度比的變化上。例如，加入過氧化氫干預后，歸屬于各氨基酸的770、1 043、1 256、1 609、1 618、1 694 cm‐1譜帶的峰強度明顯增強。尤其是歸屬于脯氨酸及谷氨酸的1 043 cm‐1譜帶，其峰強度增幅達到125%。該實驗結果證實了氧化應激反應影響了酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸等氨基酸的“C=C”振動模式。黑色素是RPE細胞中重要的抗氧化成分，且黑色素的合成需要黑色素細胞利用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等物質進行合成。此外，脯氨酸在RPE 代謝中的重要性也已得到了證實［12‐14］。一旦脯氨酸分解代謝遇到異常，RPE 細胞的葡萄糖代謝和谷胱甘肽的產生就受到影響，最終使RPE 細胞的抗氧化能力受到損害。因此，我們推測H2O2所產生的大量ROS改變了氨基酸的含量和結構，影響氨基酸的代謝，最終阻斷抗氧化物質的產生、能量代謝和蛋白質合成。不僅如此，H2O2誘導的氧化應激反應也對脂質產生影響，如歸屬于磷酸二酯的810 cm‐1譜帶和歸屬于甘油三亞油酸酯的840 cm‐1譜帶，兩者的峰強度在ROS 的作用下呈顯著下降趨勢，且降幅超過70%。此現象證實H2O2的干預使細胞內脂質氧化反應和氧自由基反應失衡。但抗氧化劑川芎嗪的加入不僅逆轉了歸屬于脂質的810 和840 cm‐1譜帶峰強度比值的變化趨勢，還使得H2O2干預后顯著提高的歸屬于各氨基酸譜帶的峰強度值有所下降，如770、1 043、1 609 cm‐1等。故推測川芎嗪對H2O2所造成的一系列氧化應激損傷具有較強的保護作用，其抗氧化的作用靶點可能與脂類相關。另外值得注意的是，分別歸屬于酰胺I和酰胺Ⅲ的譜帶1 694、1 240 和1 256 cm‐1，其峰強度值在川芎嗪的作用下出現不同程度的下降。這與我們之前得到的結果不同。表明氧化應激沒有引起RPE 細胞內酰胺的脫酰胺化，反而是在添加川芎嗪后酰胺峰強度比發生了變化。最后，我們還發現ROS 也可能影響RPE細胞的DNA核酸堿基，如譜帶1 256、574、1 454 cm‐1。

3 結論

本文利用InVia微拉曼光譜系統對過氧化氫所誘導的人RPE細胞氧化應激損傷進行了指紋分析。結果表明，H2O2干預后，RPE細胞ROS水平升高，存活率降低。添加抗氧化劑川芎嗪后，細胞ROS水平顯著降低，細胞活力測試結果也顯示川芎嗪能抑制細胞活力的下降。光譜結果顯示，施加H2O2干預的細胞與對照組細胞拉曼光譜的差異主要體現在歸屬于氨基酸和脂質分子的譜帶上。根據所影響的氨基酸類型，推斷氧化應激可能會影響RPE細胞黑色素合成、葡萄糖代謝和抗氧化劑的產生等生理過程。此外，川芎嗪的加入逆轉了歸屬于脂質的譜帶峰強度值的變化趨勢，故推測脂類是川芎嗪發揮抗氧化作用的重要靶點。與此同時，我們還發現川芎嗪可能使RPE細胞內的酰胺發生脫酰胺化。綜上，本研究使用無創無標簽拉曼光譜技術，揭示了H2O2和抗氧化劑川芎嗪潛在的作用靶點，為更好地探究視網膜RPE細胞氧化應激的損傷機制奠定了基礎。同時，為今后抗氧化藥物的研究和開發提供了一個新的方向。進一步證明了基于分子水平的拉曼光譜技術是視網膜相關疾病生物標志物檢測的有效手段。